| Resumo: | As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, principalmente nos países desenvolvidos. Para melhorar as terapias já existentes para o miocárdio é necessário, em primeiro lugar, compreender claramente os mecanismos moleculares e as vias de sinalização envolvidas por trás da cardiomiogénese. Utilizando um modelo de ratinho, foi possível observar o papel do DAND5 em dois processos embrionários distintos, um relacionado com o estabelecimento de LR e outro relacionado com a proliferação de cardiomiócitos. Além disso, em um projeto de sequenciamento do exoma, desenhado para identificar mutações associadas à assimetria esquerda-direita (LR) em humanos identificou-se uma mutação missense (c.455G>A) no exão 2 do gene DAND5 de dois doentes vivos independentes, apresentando características de assimetria LR e defeitos cardíacos associados. De acordo com a análise funcional in vitro, essa mutação leva a uma diminuição na função inibitória da proteína DAND5. No entanto, ainda há muito a aprender sobre a função de DAND5 durante a diferenciação em relação aos cardiomiócitos em humanos. Com isso em mente, iPSCs humanas (hiPSCs) derivadas de diferentes pacientes com mutação em DAND5 foram estabelecidas. Mas, para estabelecer modelos para estudar a função deste gene e, em particular, a alteração c.455G> A, linhas isogénicas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) corrigidas em DAND5 devem ser geradas. Este é um controlo importante para superar o ruído fenotípico causado por fundos genéticos variáveis de linhas PSC não relacionadas. Assim como, a geração de linhagens isogénicas de iPSC DAND5 mutantes para esclarecer o efeito da completa perda de função de DAND5 durante a diferenciação em cardiomiócitos Aqui, usando a edição de genoma mediada por CRISPR, fomos capazes de corrigir a mutação em DAND5 e gerar uma linha isogénica de hiPSC corrigida em DAND5, ou seja, é homozigótica para a base c.455G, confirmada por sequenciamento. Assim como de gerar uma isogénica hiPSC com o knockout de DAND5, após a utilização da edição do genoma mediada por CRISPR para inserir codões stop prematuros, confirmados por sequenciamento, tornando-se o gene DAND5 inoperante. A sua análise mostra então que esta linha celular mantém as propriedades hiPSC: morfologia tipo célula estaminal embrionária (ESC); análise de imunofluorescência (IF) confirmou a expressão do fator de transcrição e autorrenovação OCT4 e do marcador de superfície SSEA4, marcadores característicos de células estaminais pluripotentes; diferenciação in vitro baseada no corpo embrionário (EB) seguida de análise IF do marcador endodérmico alfafetoproteína (AFP), do marcador mesodérmico actina alfa do músculo liso (SMA) e o marcador ectodérmico tubulina βIII (TUBB3) confirmaram a pluripotencia das hiPSC e a sua capacidade de se diferenciar em todas as três camadas germinativas. Essas linhas de hiPSC são agora ferramentas úteis para a modelação de doenças e para entender o papel desse gene em pacientes com mutações em DAND5, rastreio de drogas e medicina regenerativa. Especialmente para o estudo dos mecanismos moleculares relacionados com a proliferação de cardiomiócitos.
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