| Summary: | RESUMO: As patologias oculares estão entre as condições médicas mais debilitantes que afetam todos os segmentos da população. Como as opções tradicionais de tratamento são frequentemente ineficazes e por vezes inexistentes, a terapia génica tem potencial para se tornar uma abordagem alternativa para o tratamento de diversas patologias. Os primeiros veículos desenvolvidos para entregar material genético eram de origem viral. Devido a algumas complicações clínicas iniciais, começaram a ser desenvolvidos os veículos não-virais, baseados em lipídios e polímeros. Os polímeros de metacrilato foram descritos como altamente biocompatíveis e utilizados com sucesso em aplicações médicas, como cimento ósseo e lente intraocular. Alguns destes polímeros possuem propriedades catiónicas que podem ser usadas para formar poliplexos com DNA de forma a proceder à sua entrega. O presente trabalho tem como objetivo estudar o potencial do PDMAEMA (poli(2-dimetilamino)etil metacrilato) como um sistema de administração não viral de genes à retina. Para atingir esse propósito, primeiro tentámos entender o potencial de entrega de genes do PDMAEMA que anteriormente sintetizamos. Para melhorar o PDMAEMA, é fundamental primeiro esclarecer a entrada e o mecanismo intracelular pelo qual o polímero entrega o material genético. Elucidamos o mecanismo de entrada de polyplexes PDMAEMA em células RPE ao determinar que a endocitose mediada por clatrina é a via principal para a absorção de poliplexos PDMAEMA. Em relação ao tráfico intracelular, os poliplexos escapam do sistema degradativo lisossomal 24 horas após incubação com células RPE e acumulam-se ao redor do núcleo. O estudo de dissociação sugere, desta forma, que o polímero conseguiu liberar o DNA nas primeiras 24 horas após a entrada na célula. A segunda parte deste trabalho teve como finalidade avaliar a eficiência de transfeção in vivo do PDMAEMA, usando para tal os ratinhos rd10, um modelo de Retinite Pigmentosa. Os poliplexos PDMAEMA/DNA foram preparados em duas proporções de nitrogênio/fósforo (N/P).Para validar melhor o PDMAEMA como um potencial vetor não viral na retina, injetámos poliplexos PDMAEMA subretinalmente, os quais foram capazes de entrar e promover a expressão de GFP na camada RPE da retina. O passo seguinte foi testar os poliplexos PDMAEMA num modelo de doença. Procedemos a uma caracterização do modelo da doença de Retinite Pigmentosa, dos ratinhos rd10 com marcadores para fotorreceptores: bastonetes (rodopsina e PDE6β) e cones (arrestina do cone) e observámos alterações nos padrões de expressão começando a P18. Também medimos a espessura das camadas nucleares externas (ONL) e internas (INL) e observámos uma diminuição significativa, que começava a P18 e ia até P35. Uma vez que uma mutação “missense” no gene PDE6β leva à morte de fotorreceptores, dando o rd10 o seu fenótipo, clonámos o gene PDE6β no plasmídeo pEPito-hCMV e realizámos injeções subretinais. Observámos que os polyplexos PDMAEMA foram capazes de expressar o gene PDE6β na camada nuclear dos fotorreceptores. Ao caracterizar os murganhos rd10, observamos que a proteína PDE6β não estava a ser detetada por imunofluorescência, o que nos levou a questionar se a proteína estava realmente a ser produzida. Aproveitando a PDE6β clonada no plasmídeo pEPito, realizámos mutagénese direcionada no local, de forma a explorar melhor a observação anterior. Mutámos o gene com a mutação rd10 (c> t, posição 1678) e também o codão STOP. Construímos quatro plasmídeos: pEPito-hCMV-PDE6β (PDE6β normal); pEPito-hCMV-PDE6βR560C (PDE6β mutado); pEPito-hCMV-PDE6βeGFP (PDE6β normal fundido com GFP) e pEPito-hCMV-PDE6βR560CeGFP (PDE6β mutado fundido com GFP). Os nossos resultados sugerem assim que a formação do complexo de PDE6 in vivo com PDE6βR560C mascara o site que o anticorpo reconhece, prevenindo assim a deteção de PDE6β mutada. Uma vez que o mecanismo da doença no ratinho rd10 ainda é pouco compreendido, consideramos que essas ferramentas genéticas poderão ser utilizadas para estudá-lo melhor. No seu conjunto, estes resultados sugerem, portanto, que o PDMAEMA é um candidato viável para a administração de genes não-virais à retina. No entanto, torna-se ainda necessário realizar mais injeções subretinais do nosso vetor não viral, do modo a aumentar o número de repetições e a avaliar a função da retina.
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