| Summary: | A poliadenilação alternativa (APA) é uma etapa de processamento de pre-mRNA em que isoformas alternativas de mRNA são formadas com base na escolha de um sinal de poliadenilação (pA) sobre o outro. Quando confinada à Região 3’ não-Traduzida (3’ UTR), a APA gera mRNAs que variam somente no comprimento das suas 3’ UTRs (3’UTR-APA). Vários estudos têm demonstrado o papel da APA na regulação da expressão genética. Nos mamíferos, cerca de 70% de genes são sujeitos a APA, aumentando substancialmente a diversidade do transcriptoma. APA é relevante tanto em processos fisiológicos como patológicos, modulando a estabilidade, localização e eficiência da tradução dos transcritos. Trabalhos anteriores do grupo demonstraram que o gene Myeloid Cell Leukemia 1 (MCL1) tem dois sinais de poliadenilação ativos em células T humanas, denominados pA1 e pA2, e que a isoforma pA2 é susceptível à regulação pós-transcripcional pelo miR-17 no citoplasma. O produto proteico comum às duas isoformas de APA – Mcl-1, é um membro anti-apoptótico da família Bcl-2, crucial tanto no câncro como na sobrevivência das células T. Um dos objectivos desta dissertação consistiu em abordar a influência das duas isoformas de APA de MCL1 na localização subcelular de Mcl-1 e em verificar se o miR-17 tem um impacto no seu nível de produção proteica. Deste modo, os seguintes construtos de expressão contendo a sequência codificante de MCL1 (CDS), seguida pela sequência da 3’ UTR curta ou longa, foram transfetados em células HeLa; pEGFP MCL1 CDS pA1, pEGFP MCL1 CDS pA2 e MCL1 CDS pA2ΔmiR17, e a localização de Mcl-1 foi verificada através da microscopia confocal. Pretendíamos ainda otimizar o método da deleção dos sinais pA em células difíceis de transfetar (Jurkat E6.1), através do uso de construtos CRISPR/Cas9 do tipo all-in-one e transdução lentiviral. Para além de planear a criação de linhas com um dos sinais pA de MCL1 deletado: MCL1ΔpA1 e MCL1ΔpA2, respectivamente, o nosso objectivo consistiu em criar linhas estáveis knock-out (KO) para ambos alelos em dois genes envolvidos no processamento de RNA: INTS9 e CPSF1, para estudar a sua função na APA e na expressão de MCL1. Os ensaios de localização mostraram que Mcl-1 derivado da isoforma pA1 é predominantemente expresso na mitocôndria, enquanto Mcl-1 derivado da isoforma pA2 tem uma localização ubíqua. Além disso, a quantificação da intensidade de EGFP mostrou que a isoforma pA1 produz ~ 3 vezes mais proteína que a pA2 e que o miR-17 não é responsável pela baixa expressão de Mcl-1. Por outro lado, a genotipagem das populações de E6.1 submetidas a CRISPR/Cas9 revelou deleções em alelos de quase todas as condições. De seguida, a heterozigotia foi detectada em clones isolados por single-cell sorting. Em conclusão, os estudos de localização provam que a regulação da expressão genética mediada pela 3’ UTR modula tanto o destino como a distribuição subcelular proteica. As abordagens CRISPR/Cas9 foram bem-sucedidas, contudo, a homozigotia ainda está por alcançar, para permitir a realização de ensaios funcionais. Em suma, estes resultados ajudam a esclarecer a regulação de isoformas de mRNA derivadas de 3’ UTR-APA de MCL1, proporcionando-nos oportunidades para aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos e os fatores moleculares subjacentes.
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