Desenho de chips de DNA para o diagnóstico de infecções fúngicas - Pereira, Jacinto José Fonseca (2011)
A tecnologia de microarrays tem uma vasta gama de aplicações em biologia molecular e medicina. Uma delas é capacidade de diagnosticar infecções patogénicas em pacientes humanos. Neste projecto, foram implementadas ferramentas bioinformáticas de selecção de sondas de DNA para desenhar chips de DNA para o diagnóstico de infecções provocadas por fungos patogénicos. O objectivo principal deste estudo é identificar, para cada espécie, um conjunto de sondas de DNA específicas. Cada sonda consiste num oligonucleótido que hibrida com apenas uma espécie fúngica descoberta até à data. O sistema foi testado utilizando 10 espécies de fungos patogénicas que apresentam elevada proximidade. Para isso, foram pesquisadas bases de dados online e extraídas as sequências de DNA pertencentes aos genes do RNA ribossomal (SSU, ITS1, ITS2, LSU), que exibem variabilidade entre espécies. Estas sequências foram de seguida submetidas a alinhamentos múltiplos e “par a par” sistemáticos, no sentido de se determinar os oligonucleótidos mais específicos para cada espécie. Este processo foi executado com recurso aos algoritmos BLAST e Clustal, a algoritmos de cálculo da temperatura de fusão e a scripts de PERL. Finalmente, as sequências foram validadas contra uma base de dados universal, para verificar a especificidade de cada sonda. Para solucionar o problema da baixa concentração de DNA fúngico em amostras clínicas, foram desenhados pares de primers para a amplificação por PCR de secções dos 4 genes de rRNA nas 10 espécies de fungos simultaneamente. ABSTRACT: Microarray technology has a wide variety of applications in molecular biology and medicine. One of these is the diagnostics of pathogenic infections in human patients. In this project, bioinformatics tools for DNA probe selection were set up to design DNA chips for the diagnosis of infections caused by pathogenic fungi. The main objective of the study was to identify, for each fungal species, a set of specific DNA probes. Each probe consists of an oligonucleotide that hybridises with only one, presently discovered, fungal species. The system was tested using 10 closely related pathogenic fungal species. For this, online databases were searched and DNA sequence data belonging to ribosomal RNA genes (SSU, ITS1, ITS2, LSU), which exhibit variability between species, was downloaded. These sequences were then subjected to systematic pairwise and multiple alignments in order to find the most specific oligonucleotides for each species. This procedure was performed with the BLAST and Clustal algorithms, melting temperature calculation algorithms and PERL scripting. Finally, the sequences were validated against a universal database in order to verify the specificity of each probe. To overcome the problem of the low concentration of fungal DNA in clinic samples, pairs of primers were designed for the PCR amplification of sections of 4 rRNA genes in 10 species simultaneously.