Desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA contra Photobacterium damselae subsp. piscicida - Santos, Beatriz Isabel Pires dos (2021)
Uma das bactérias frequentemente encontrada em aquacultura é Photobacterium damselae subsp. piscicida. Esta bactéria é responsável pela doença fotobacteriose, afetando mais de vinte espécies. Um dos grandes fatores de virulência desta bactéria é a capacidade de adquirir ferro do hospedeiro pela produção de sideróforos específicos, piscibactinas, sendo esta transportada pela proteína FrpA. Já existem alguns tipos de vacinas no mercado contra fotobacteriose, mas nenhuma é uma vacinas de DNA. Este trabalho tem como objetivo construir plasmídeos que codificam a sequência genética da proteína FrpA ou fragmentos desta proteína escolhidos por terem elevado potencial imunológico, desenvolver e produzir vacinas de DNA utilizando estes plasmídeos e verificar a sua eficácia, testando-as em robalos juvenis e avaliando a sua eficácia, recorrendo a ELISA indireto e à análise da percentagem relativa de sobrevivência (RPS). Desenharam-se três plasmídeos: um com o gene completo da proteína FrpA, pVAX-FrpA-GFP, e dois plasmídeos com sequencias genómicas dos fragmentos escolhidos, pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP. Apenas se conseguiu obter os plasmídeos com os fragmentos. Estes plasmídeos foram produzidos em quantidade necessária para vacinar 78 robalos (com certa de 15 g) por tratamento, havendo 4 tratamentos em triplicado. No tratamento 1 foi utilizada uma vacina contendo pVAX-GFP suplementada com adjuvante Montanide ISA 763 A VG, nos tratamentos 2 e 3 foram utilizadas vacinas suplementadas com o mesmo adjuvante, mas contendo os plasmídeos pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP, respetivamente. Por último, no tratamento 4 foi utilizada uma vacina contendo também pVAX-Frag6-GFP, porém suplementada com o adjuvante Montanide Gel 02 PR. A dose administrada de vacina para cada tratamento foi de 1,2 μg pDNA/g peixe. Os peixes controlo foram injetados com PBS estéril. Os peixes tratados com vacinas suplementadas com Montanide ISA contendo os plasmídeos pVAX-GFP e pVAX-Frag1-GFP sofreram mortalidade, no tempo de imunização, de 12% e 26%, respetivamente. Esta pode estar relacionada com os efeitos secundários deste adjuvante. Por outro lado, apenas em peixes vacinados com este adjuvante foram detetados títulos de anticorpos e aumento destes ao longo do tempo (de 15 dias para 30 dias após vacinação), nos ensaios ELISA indireto. Todas as vacinas concederam valores de RPS elevados após infeção, superiores a 70%. A vacina pVAX-Frag6-GFP suplementada com Montanide ISA alcançou um RPS de 93%, seguida da vacina contendo o vetor pVAX-GFP com um RPS de 86% e depois, as vacinas contendo os plasmídeos pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP suplementadas com Montanide ISA e Montanide Gel, respetivamente, com um RPS de 73%. Os peixes de controlo, injetados com PBS obtiveram um valor de RPS de 0%, não havendo sobrevivência após 5 dias de infeção.