Aplicação de métodos moleculares na avaliação da diversidade de fungos entomopatogénicos da traça da oliveira - Oliveira, Ivo Vaz (2011)
A aplicação de métodos moleculares para a identificação de fungos, incluindo os entomopatogénicos, é uma ferramenta de elevado interesse. Permite uma identificação correcta da espécie e isenta de dúvidas, diminuindo o tempo que seria necessário, por exemplo, para uma identificação morfológica. Existem várias regiões do ADN fúngico propostas para a identificação de espécies -"barcode" - tais como a região espaçadora transcrita interna (ITS - Internal transcribed spacer), regiões intrónicas de ~-tubulina, RNA polimerase II (RPB2) e factor de elongamento 1 alfa (EF1a), entre outras. Todas elas apresentam vantagens e desvantagens associadas ao seu uso, quer sejam pela dimensão dos fragmentos amplificados, facilidade de amplificação e utilização de primers universais, quer pela variação ao nível das sequências, intra- e inter-espécies. Este trabalho incidiu na pesquisa de fungos entomopatogénicos associados a uma das principais pragas presentes nos olivais transmontanos, a traça da oliveira (Prays oleae Bern.), e à sua identificação usando métodos moleculares, optando-se pelo uso da região ITS para a identificação das espécies. Esta região tem sido amplamente usada na identificação de espécies, devido a uma série de vantagens, como a facilidade de amplificação, utilização de primers universais e elevado nível de variação nas sequências, que ocorre mesmo entre espécies fortemente relacionadas. Para além disso, estão actualmente disponíveis em diversas bases de dados, sequências de um elevado número de fungos para comparação. Após a obtenção de culturas puras de fungos isolados directamente de cadáveres de traça da oliveira, procedeu-se à extracção do ADN fúngico e à amplificação da região ITS por PCR, com recurso aos primers universais ITS1 e ITS4. Usando os mesmos primers, procedeu-se à sequenciação do ADN amplificado, sendo as sequências analisadas com o software DNASTAR v.2.58 e comparadas directamente com as depositadas na base de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information), usando o algoritmo BLAST. Do total de isolados obtidos, a grande maioria foi identificada através desta metodologia. No entanto, para cerca de 22% dos isolados, a identificação foi apenas possível ao nível do género. Serão discutidas as vantagens e desvantagens desta abordagem da identificação de espécies, bem como os géneros em que a identificação foi mais problemática.