Characterization of monocarboxylate permeases in yeast : functional and structural analysis - Silva, Isabel Soares (2006)
Os ácidos carboxílicos de cadeia curta são compostos importantes produzidos de forma natural no decorrer de numerosos processos metabólicos, para além de poderem ser utilizados como única fonte de carbono e energia por diversos seres vivos, incluindo leveduras. É neste contexto que o estudo das permeases de monocarboxilatos se reveste de especial importância, dado que o transporte destes nutrientes através da membrana é um factor essencial no metabolismo da grande maioria das células. Com o trabalho descrito na presente tese procurou-se desenvolver o conhecimento actual sobre permeases de monocarboxilatos de leveduras, através de um aprofundamento do estudo da permease de lactato/piruvato de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene JEN1. A primeira etapa deste trabalho consistiu na expressão heteróloga do gene JEN1 na levedura Pichia pastoris. Este gene foi clonado num vector do tipo integrativo (pPICZB) assim como num vector replicativo vector (pZPARS), e posteriormente expresso em duas estirpes diferentes, Mut+ e Muts. A confirmação da expressão do gene JEN1 foi efectuada em células induzidas 24 horas em metanol tanto ao nível do mRNA como ao nível proteico. A actividade máxima da permease obtida em células de P. pastoris apresentou um Vmax de 2,1 nmol s-1 mg-1 peso seco. Este valor representou um aumento de cinco vezes comparativamente com os parâmetros descritos na literatura para células da estirpe selvagem crescidas em lactato. Numa segunda fase, a actividade da permease foi reconstituída em vesículas híbridas, obtidas por fusão de membranas extraídas a partir de células de P. pastoris induzidas em metanol e lipossomas de Escherichia coli contendo citocromo c oxidase, como proteína geradora de uma força proto-motriz. A actividade da proteína reconstituída apresentou propriedades semelhantes à proteína selvagem de S. cerevisiae no que diz respeito ao simporte de protões como mecanismo acoplado ao transporte de lactato e também aos inibidores testados. Com este trabalho foi possível demonstrar a funcionalidade da proteína Jen1 de S. cerevisiae como sendo um transportador de lactato. A caracterização molecular de outros genes codificantes de permeases de monocarboxilatos levou-nos ao estudo do transporte de ácidos monocarboxílicos na levedura Candida albicans. A presença de uma permease de monocarboxilatos foi identificada em células da estirpe C. albicans RM1000 crescidas em lactato. Estudos de inibição demonstraram que o transporte de lactato é inibido competitivamente por piruvato e propionato, mas não por acetato que se revelou ser um inibidor não competitivo. Uma pesquisa de homólogos do gene ScJEN1 em C. albicans revelou a existência de uma ORF com 61% de similaridade que foi designada por CaJEN1. Deleções de ambos os alelos de C. albicans originaram uma ausência de detecção do CaJEN1 mRNA e da actividade da permease. Em células da estirpe selvagem C. albicans RM1000 crescidas em glucose não se verificou expressão do CaJEN1 assim como não foi possível detectar actividade da permease. A expressão heteróloga do gene CaJEN1 foi efectuada na estirpe S. cerevisiae jen1Δ, mas não foi recuperado o transporte de ácido láctico. A levedura C. albicans possui uma alteração no código genético o que faz com que a proteína CaJen1 ao ser expressa em S. cerevisiae possua uma mutação S217L. Foi aplicada a técnica de mutagénese dirigida de forma a restabelecer a sequência proteica original, sendo desta forma recuperada actividade da permease em S. cerevisiae. Com este estudo confirmou-se que o gene CaJEN1 codifica um transportador de monocarboxilatos em C. albicans. Estudos adicionais com uma estirpe deletada no gene CaCAT8 demonstraram que a expressão deste gene influencia a expressão do CaJEN1, fenómeno idêntico ao que se verifica com os correspondentes genes homólogos de S. cerevisisae. Na última parte do trabalho efectuou-se uma pesquisa de domínios da ScJen1p envolvidos no reconhecimento/transporte do substrato. Foi efectuada uma análise por mutagénese da sequência 379NXX[S/T]HX[S/T]QDXXXT391 em cinco dos aminoácidos conservados. A substituição dos resíduos N379, H383 ou D387, mesmo que por aminoácidos muito similares, provocou uma acentuada redução do transporte de lactato e piruvato mas manteve transporte de acetato mensurável. Ensaios de inibição de transporte de acetato demonstraram que estes mutantes têm a capacidade de ligar mas não de transportar lactato e piruvato. Ensaios de transporte com o duplo mutante H383D/D387H demonstraram a existência de interacções entre estes dois aminoácidos, dado que este exibe uma perda de função para o transporte de lactato e piruvato mas apresenta parâmetros cinéticos idênticos ao Jen1p para o transporte de acetato. As mutações nos resíduos N379, H383 e D387 afectam simultaneamente a capacidade de transporte e a especificidade da Jen1p. Quanto aos aminoácidos Q386 eT391 o seu efeito parece ser mais ao nível da afinidade de ligação ao substrato do que na capacidade de transporte. Na sua globalidade estes resultados sugerem que a sequência aqui estudada intervém na via de translocação do substrato da permease de lactato/piruvato de S. cerevisiae.