Aplicação de antibióticos como ligandos em cromatografia de afinidade para purificação de DNA plasmídico - Nunes, Catarina Caramelo (2014)
As Terapias Moleculares, como a Terapia Génica e as Vacinas de DNA, estão a criar um aumento da procura de grandes quantidades de DNA plasmídico (pDNA) puro. Apesar de já estarem disponíveis vários métodos, baseados em protocolos da biologia molecular, para a purificação de plasmídeos, a grande maioria não são apropriados para o uso em larga escala. Para além disso, esses protocolos usam com frequência reagentes tóxicos, os quais impedem a sua utilização para a purificação de produtos terapêuticos. Já os métodos baseados na afinidade usados até agora, parecem ser bastante promissores, contudo a maior parte faz uso de macrobiomoléculas de preços elevados, que impedem a sua utilização extensiva. Sabe-se que são várias as moléculas que ligam ao DNA com uma especificidade elevada, como certos antibióticos e agentes anticancerigenos. É o caso das moléculas focadas neste estudo: a neomicina e a berberina. Desta forma, estes ligandos representam uma boa alternativa para a aplicação a protocolos de purificação por afinidade. Tendo esse objectivo em mente, as afinidades de ligação entre as moléculas acima mencionadas e um pDNA modelo (pVax1LacZ), foram avaliadas, recorrendo à técnica de titulação fluorimétrica desenvolvida por Strothkamp. A titulação do pDNA com brometo de etídio (BrEt) foi seguida através da intensidade de fluorescência, na ausência e presença de diferentes concentrações dos ligandos em estudo. Aos dados obtidos foi aplicado o método de Scatchard, para assim se determinar o efeito de cada um dos compostos na ligação do BrEt ao pDNA. As constantes de ligação de cada composto foram depois calculadas para diferentes concentrações de cloreto de sódio. Os resultados obtidos mostram que o antibiótico que apresenta a constante de afinidade mais elevada é a berberina, a uma concentração de cloreto de sódio 1,0 M, podendo assim ser um ligando promissor para a purificação de pDNA por afinidade. O suporte escolhido para os ensaios de cromatografia de afinidade foi o Epóxi – (CH2)4 – Sepharose™, contudo a berberina não contém grupos hidroxílicos funcionais para poder ser directamente imobilizada. Desta forma, foram realizados estudos visando a clivagem do seu grupo metilenodióxido para a obtenção de um catecol, alcançando-se os melhores resultados através do uso de tricloreto de alumínio, como activador. Porém, em vez de um único composto, foi obtida uma mistura de quatro produtos, derivados da hidrólise dos grupos metóxido. Ainda assim, procedeu-se à imobilização da mistura ao suporte e analisou-se a interacção do gel obtido com o pDNA. Estudou-se também a influência da concentração de sal no perfil cromatográfico. Os resultados obtidos mostram que, para todas as concentrações de sal, a amostra foi imediatamente eluída após a injecção, sem qualquer retenção na coluna. Este pode ter sido consequência de uma possível baixa densidade de ligandos na coluna ou ao facto da constante de afinidade calculada não representar a verdadeira afinidade existente entre a berberina e o pDNA. O facto de a derivatização ter sido realizada com quatro compostos diferentes, pode também ter sido responsável pela má retenção. Uma vez que esta foi a primeira vez que um antibiótico foi usado como ligando para a purificação de pDNA, criou-se um campo de investigação promissor e pouco explorado, que poderá melhorar e simplificar os protocolos já existentes, para além de, num futuro próximo, poder ser usado para implementar esta abordagem cromatográfica à purificação, em larga escala, de vectores plasmídicos para serem usados nas terapias moleculares.