Otimização da técnica de array CGH em diagnóstico pré-natal - Gonçalves, João Carlos Martins (2014)
A implementação da tecnologia de array CGH como rotina no diagnóstico pré-natal tem vindo a ser discutida nos últimos tempos. Contudo, esta introdução necessita de uma estratégia adequada que garanta a obtenção de DNA de qualidade diretamente a partir de amostras fetais, sem recorrer a cultura de células. Neste estudo delineou-se e otimizou-se uma estratégia de extração e purificação de DNA a partir de líquido amniótico direto, que permitiu a realização de array CGH em diagnóstico pré-natal. Foram selecionados dois protocolos comerciais de extração de DNA que foram otimizados e comparados entre si, de modo a determinar o que apresentava melhor rendimento e qualidade. O controlo da qualidade do DNA obtido foi feito recorrendo a espectrofotometria, a análise do grau de fragmentação através de corrida em gel de agarose e a uma validação dos resultados através de aplicação comparativa numa plataforma de array CGH 180K. A estratégia que garantiu melhores concentrações de DNA de qualidade para análise foi validada recorrendo a 10 amostras de líquido amniótico direto. O estudo efetuado demonstrou que a maioria das amostras, principalmente com um menor número de semanas de gestação, necessitam da realização de um protocolo adicional de concentração e purificação de DNA, para além do protocolo de extração de DNA, de modo a garantir os parâmetros mínimos de quantidade e qualidade para a realização de pelo menos um ensaio de array CGH. A comparação de DNA extraído pelos dois protocolos otimizados não revelou diferenças significativas entre si, e, como tal, optou-se por adotar, na estratégia de extração, o protocolo com a melhor relação custo/benefício. A validação da estratégia estudada em 10 amostras de líquido amniótico revelou valores de quantidade e qualidade de DNA que permitem a realização de array CGH para os volumes iniciais de líquido testados. Os resultados deste trabalho reforçam a importância da tecnologia de array CGH em DPN e demonstram uma estratégia de extração, concentração e purificação de DNA, partindo de líquido amniótico direto recolhido a partir das 15 semanas de gestação com parâmetros de quantidade/qualidade que permitem a realização de array CGH.