Estudo da resistência de Pneumocystis jirovecii ao cotrimoxazol em doentes com infecção VIH SIDA - SILVA, Marina Célia Nunes Ferreira da Costa Henriques da (2019)
Pneumocystis jirovecii é um eucariota responsável por um quadro clínico de pneumonia intersticial grave em indivíduos imunocomprometidos. Apesar do decréscimo da incidência da pneumonia por P. jirovecii (PPc) como resultado da introdução da profilaxia específica e da terapêutica antirretroviral potente (HAART, do inglês “Highly active antiretroviral therapy”), esta doença continua a ser uma das infecções oportunistas mais frequentes em doentes com infecção vírus da imunodeficiência humana/síndroma de imunodeficiência adquirida (VIH/SIDA) e com outras imunodeficiências. Os fármacos da família das sulfas, em especial o cotrimoxazol, uma combinação de sulfametoxazol e de trimetoprim, são considerados os agentes de primeira linha na profilaxia e no tratamento desta infecção. Ao longo dos últimos anos, tem sido estudada a variabilidade genética da dihidropteroato sintetase (DHPS) e da dihidrofolato reductase (DHFR), duas enzimas alvo do cotrimoxazol, de P. jirovecii com o intuito de avaliar o possível desenvolvimento de resistência a este fármaco. Por outro lado, o estudo de outros marcadores genéticos, como as regiões dos espaçadores internos transcritos (ITS, do inglês "Internal Transcribed Spacers"), em conjunto com o DHPS e o DHFR, tem sido utilizado no sentido de melhor compreender os mecanismos de desenvolvimento de resistência ao cotrimoxazol. Com o presente estudo, pretendeu-se efectuar a caracterização genética da DHPS, da DHFR e das regiões ITS de P. jirovecii, em isolados obtidos entre 1995 e 2004, em doentes imunocomprometidos. Também foi objectivo deste trabalho, estudar a relação dosgenótipos identificados nas três regiões genómicas em análise, entre si e com diversas variáveis clínicas e epidemiológicas. Entre os 403 isolados de P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2004, a percentagem de infecção por P. jirovecii observada foi de 64,5%. No total, 290 isolados de P. jirovecii identificados no período de 2001–2004 (260 isolados) e entre 1995–2000 (30 isolados), foram submetidos ao estudo de caracterização genética, nos três loci em estudo. Inicialmente, com o intuito de melhorar a técnica de amplificação do gene da DHPS de P. jirovecii, procedeu-se á filtração das amostras de secreções pulmonares, para remoção de DNA do hospedeiro contaminante, e foi elaborado um novo protocolo de amplificação. Apesar, de se ter verificado que o processo de microfiltração não promovia uma melhor amplificação de DNA específico de Pneumocystis, o protocolo de PCR “nested” desenhado contribuiu para a maior amplificação do gene da DHPS de P. jirovecii (P <0,001). A caracterização genética da DHPS e da DHFR, permitiu identificar o genótipo selvagem em 84,5% e 68,9%, respectivamente, dos isolados estudados. Em 15,5% dos isolados, observou-se a presença de genótipos mutantes nos codões 55 e 57 do gene da DHPS. Em relação ao gene da DHFR, 31,1% dos isolados apresentaram polimorfismos. No total, foram identificados nove locais de substituição: quatro substituições sinónimas, nas posições nucleotídicas 201, 272, 312 e 381; cinco substituições nucleotídicas não sinónimas nas posições 38, 68, 92, 154 e 200 que resultaram na alteração nos codões 13, 23, 31, 52 e 67, respectivamente. No estudo efectuado, verificou-se que as mutações do gene da DHPS, foram mais frequentes entre os isolados obtidos em 1995-2000 do que entre os isolados recolhidos entre 2001 e 2004 (P=0,056). Relativamente ao gene da DHFR e, em contraste com a maioria dos estudos publicados, observou-se uma elevada diversidade genética entre os isolados estudados.Também, nas regiões ITS de P. jirovecii, foi observada uma elevada variabilidade entre os isolados estudados. No presente trabalho, 30 genótipos diferentes foram identificados, o que evidencia o elevado grau de diversidade genética destas regiões e a sua utilidade no estudo da transmissão e da epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, os genótipos mais frequentes foram o Eg, o Cg e o Gg. Verificou-se que o genótipo Ne foi significativamente mais frequente entre 1995–2000 (P= 0,026) enquanto que o genótipo Eg foi mais frequente entre 2001–2004 (P=0,011). Considerando a combinação dos genótipos identificados nestas três regiões genómicas, foram observados 50 haplótipos distintos em 100 isolados de P. jirovecii. A elevada diversidade intra-específica observada neste estudo multilocus demonstra o potencial que esta abordagem pode ter na diferenciação de tipos P. jirovecii distintos e a sua utilidade no estudo da transmissão e da epidemiologia da PPc. No estudo efectuado, polimorfismos nos genes da DHPS e da DHFR, presumidamente associados à exposição ao cotrimoxazol, foram detectados em doentes não expostos a este fármaco. Esta observação pode sugerir que estas sequências polimórficas possam ser adquiridos acidentalmente, por transmissão pessoa-a-pessoa ou através de uma fonte ambiental, e não somente por pressão selectiva do cotrimoxazol. Também, a identificação de genótipos idênticos, nas três regiões genómicas em estudo, em diferentes populações de doentes sugere a ocorrência de transmissão pessoa-a-pessoa. No geral, o presente trabalho contribuiu para a clarificação do papel das mutações nos genes da DHPS e da DHFR no possível desenvolvimento de resistência ao cotrimoxazol em P. jirovecii assim como para a melhor compreensão da transmissão e da epidemiologia da PPc.