| Summary: | RESUMO: A plasticidade sináptica é um mecanismo intrínseco do sistema nervoso, essencial para modificar e criar novas conexões sinápticas, suportando processos neuronais como a aprendizagem e memória. A conectividade neuronal é maioritariamente geneticamente determinada; no entanto, os neurónios também podem remodelar a sua morfologia adicionando ou eliminando estruturas sinápticas em resposta à atividade. Defeitos nesta forma de plasticidade estrutural estão descritos como sendo a causa de várias doenças neurodegenerativas. Embora algumas vias de sinalização envolvidas neste processo já tenham sido identificadas, como é que a atividade induz mudanças estruturais e como é que deficiências nesses mecanismos podem levar à doença, está longe de ser compreendido. Desta forma, o nosso objetivo é estudar como os neurónios alteram sua estrutura em resposta à atividade e identificar as vias que regulam esse processo. Utilizamos a junção neuromuscular da Drosophila melanogaster como modelo para plasticidade estrutural, pois a sua morfologia é estereotipada, mas exibe uma plasticidade estrutural robusta, o que permite o estudo do mecanismo pelo qual os neurónios crescem a alteram a sua forma. Resultados recentes do laboratório indicam que novas estruturas pré-sinápticas (botões sinápticos) emergem rapidamente (em segundos) com uma morfologia arredondada, associados a intensa contração muscular. Foi também demostrado que, ao contrário dos processos de migração mediada por cones de crescimento, a formação de botões em resposta a atividade assemelha-se mais com um mecanismo diferente, chamado de blebbing . Blebs são protusões de membrana induzidas por pressão, e resultantes da contração do córtex de actina através de motores de miosina. Alguns estudos mostraram que a alta contratilidade é acompanhada por variações cíclicas de Ca2+ intracelular e, mesmo em alguns casos, esse aumento no Ca2+ precede o aparecimento de blebs. Tendo isto em consideração, colocámos como hipótese se o Ca2+ poderia ser o sinal que inicia a formação local de botões sinápticos, fornecendo especificidade temporal e espacial. Para testar esta hipótese, fizemos vídeos de microscopia de larvas de Drosophila expressando um marcador de membrana neuronal juntamente com um sensor de cálcio geneticamente codificado, GCamP6f. Para induzir atividade realizamos protocolos de despolarização neuronal usando soluções com alta concentração em K+ e Ca2+. Estes protocolos estão bem descritos como suficientes para induzir a remodelação pré-sináptica em apenas alguns minutos após a estimulação. Observamos que todos os eventos de formação e retração de botões são precedidos por um aumento repentino e de grande magnitude no Ca2+ intracelular. A diferença entre esses dois fenómenos foi que, enquanto na formação de botões, o sinal GCaMP6f é sustentado no novo botão, na retração do botão o sinal dissipa-se rapidamente após o aumento repentino. Uma vez que se sabe que elevações de Ca2+ podem regular a contração do córtex de actina, estes resultados sugerem que a formação e a retração de botões podem ter um mecanismo de iniciação comum através da regulação da miosina. O facto de os novos botões terem um sinal GCaMP6f elevado e prolongado (em oposição às estruturas retraídas ) pode refletir a remodelação do citoesqueleto celular ou o recrutamento de vesículas sinápticas. Para entender qual a fonte do sinal de Ca2+, manipulamos as concentrações extracelulares deste ião e os canais de Ca2+ nos neurónios motores, sempre no contexto de protocolos de atividade. Existem vários canais que estão descritos como cruciais, não apenas para a migração neuronal, mas também para a atividade neuronal. Além disso, o Ca2+ citoplasmático também é influenciado por organelos como o retículo endoplasmático e mitocôndrias. Os nossos dados sugerem que a regulação negativa dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem nos neurónios motores não afeta significativamente a formação de novos botões. Por outro lado, o aumento intracelular de Ca2+ pela regulação negativa de uma ATPase de Ca2+ do retículo aumenta a formação de botões, o que implica que diferentes origens de Ca2+ podem contribuir de maneira diferente para alterações pré-sinápticas durante a atividade. Este estudo expande a nossa compreensão dos mecanismos que controlam o crescimento pré-sináptico num neurónio num sistema in vivo. Potencialmente, este trabalho pode contribuir para entender como a plasticidade estrutural neuronal pode ser manipulada e usada como estratégia neuroprotetora para tratar doenças em que haja perda neuronal.
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