Detecção molecular de Pneumocystis jirovecii no doente imunodeprimido - Campos, Carla Manuela Moutinho Silva (2011)
O diagnóstico rápido das doenças infecciosas, particularmente daquelas que representam um problema de saúde pública, apresenta-se como um dos maiores desafios para a microbiologia. Uma das doenças que mais tem merecido a atenção dos técnicos é a pneumocistose, provocada por um microorganismo oportunista particularmente activo na população imunodeprimida e que se encontra distribuído por todos os continentes e climas: o Pneumocystis jirovecii, anteriormente conhecido como Pneumocystis carinii. Identificado há quase cem anos por Carlos Chagas, o Pneumocystis jirovecii sempre revelou características atípicas, tendo sido, durante muitos anos classificado como um protozoário, até que, em 1988, foi reclassificado como fungo. Contudo, muito há ainda por descobrir quanto à sua natureza e à forma como é adquirido e transmitido. As metodologias que são normalmente utilizadas na rotina laboratorial para a detecção de Pneumocystis jirovecii requerem técnicas de coloração não específicas, já que, até hoje, tem sido impossível obter o crescimento e isolamento in vitro deste microorganismo. Apesar de estas técnicas serem ainda uma referência, começam a ser aplicados métodos emergentes, como é o caso dos métodos moleculares, entre os quais se tem vindo a destacar o método de reacção de polimerização em cadeia (PCR). Com este trabalho pretendeu-se, por um lado, fazer uma revisão e compilar os avanços dos conhecimentos sobre Pneumocystis jirovecii, com especial incidência naqueles que se relacionam com o diagnóstico laboratorial de pneumocistose, e, por outro lado, desenvolver uma metodologia de PCR capaz de detectar eficazmente esta doença, avaliando-a e comparando-a com a metodologia de coloração por imunofluorescência indirecta. Para tal fim, foram analisadas 200 amostras de lavados broncoalveolares (LBA), de 184 doentes imunodeprimidos pelo síndrome de imunodeficiência adquirida, confrontando-se ainda os resultados obtidos com os processos clínicos desses pacientes. Feito o estudo, verificou-se ser elevado o grau de concordância entre os resultados das duas metodologias utilizadas, ainda que pela metodologia de PCR desenvolvida, tivessem sido detectadas 37 amostras positivas para Pneumocystis jiroveci, mais 10 do que aquelas que foram assinaladas com a utilização da técnica da imunofluorescência indirecta. Tomada como referência esta última metodologia, os resultados do PCR apresentaram uma sensibilidade e uma especificidade de 93%, sendo os seus valores preditivos positivo e negativo, respectivamente, de 68% e de 98%. A comparação da frequência dos resultados positivos em função da faixa etária e do sexo dos doentes não apresentou diferenças significativas quanto ao primeiro de tais parâmetros. Já em relação ao género, a metodologia de PCR revelou percentagens de detecção em indivíduos do sexo feminino (30.0%) superior às verificadas em indivíduos do sexo masculino (15.6%). Analisados os processos clínicos dos doentes, verificou-se que, quando se define a pneumocistose apenas com base em elementos clínicos, o desempenho das duas metodologias laboratoriais é muito idêntico, ainda que o PCR tenha detectado cinco resultados positivos que não haviam sido assinalados pela imunofluorescência indirecta, o que denota uma maior sensibilidade da metodologia molecular. De todo o modo, o estudo dos processos, não revelou que essa maior sensibilidade se traduzisse numa capacidade preditiva comparativamente inferior à da outra metodologia. Com toda a informação obtida através deste trabalho, julga-se ter ficado melhor demonstrada a utilidade e a importância do desenvolvimento de metodologias como a do PCR para a optimização da detecção do Pneumocystis jirovecii, o que é ainda mais premente quando se está perante doentes com outras patologias e com indicadores clínicos bastante diversos. ABSTRACT: The rapid diagnosis of infectious diseases, particularly of those that can pose problems to public health, represents one of the greatest challenges to microbiology. One of the diseases which has attracted much attention from researchers is Pneumocystis pneumonia (PCP). This disease is caused by an opportunist microorganism, mainly active in immune compromised population and can be found in any continent, under any climate: the Pneumocystis jirovecii, known before as Pneumocystis carinii. This microorganism, identified by Carlos Chagas almost a hundred years ago, has always shown atypical features. Classified as a protozoan for a long time, it was reclassified as a fungus in 1988; however, there is still a lot to be found concerning its nature and the way it is caught and transmitted. The methodologies usually used in routine lab work to detect Pneumocystis jirovecii require non-specific coloration techniques, since it has been impossible to get the growth and isolation in vitro of this microorganism. Although these techniques are still a reference, other emergent methods have been applied, as is the case of molecular methods, among which the polymerase chain reaction method (PCR) has to be highlighted. The aims of this study are, on the one hand, to review and compile knowledge advances on Pneumocystis jirovecii, mainly the ones related to PCP laboratorial diagnosis, and on the other hand, to develop a PCA methodology able to detect this disease effectively, by assessing and comparing it with the coloration method through indirect immunofluorescence assay (IF). For such reason, 200 bronchoalveolar lavages (BAL) samples, taken from 184 HIV immune compromised patients, were analysed and their results compared with those patients’ clinical files. It was observed a high correlation between the results obtained from both methods used. Still, the use of the PCR method allowed the detection of 37 Pneumocystis jirovecii positive samples, 10 more than those detected through the use of indirect immunofluorescence technique. Taking as reference this last methodology, the PCR results have presented a sensitivity and a specificity of 93%, being their positive and negative predictive values of 68% and 98% respectively. When comparing the frequency of results regarding age and gender, tests showed no significant differences among patients of different age; in regard to gender, the PCR methodology exposed a higher detection in female patients (30%) than in males (15.6%). After analyzing the patients’ clinical files, it was confirmed that when Pneumocystis pneumonia is defined based only on clinical elements, the performance of the two lab methodologies is very similar; still, the PCR has detected five positive results undetected by indirect immunofluorescence assay, which shows the molecular methodology has greater sensitivity. However, the study of the files doesn’t show this greater sensitivity means a lower predictive capacity when compared to the other methodology. All the information collected from this research emphasizes the usefulness and importance of developing methodologies such as the PCR in order to optimize the detection of Pneumocystis jirovecii. This turns even more urgent as we are addressing to patients with other pathologies and quite diverse clinical indicators.