Lanthipeptides of Archaea : the case study of Haloferax mediterranei - Costa, Hugo Filipe Rangel da (2018)
Os produtos naturais são ainda hoje a maior fonte de descoberta de novas moléculas. Os lantipéptidos são um grupo de produtos naturais que pertencem à família de péptidos sintetizados pelos ribossomas e sujeitos a modificações pós-traducionais (RiPPs). Estas modificações incluem a desidratação de Ser e Thr e a ciclização entre estes aminoácidos desidratados e a Cys, dando origem aos característicos anéis de lantionina (Lan) e/ou metilantionina (MeLan). Estas reações são catalisadas por diferentes tipos de enzimas (LanB, LanM, LanKC e LanL), que constituem a base da classificação destes péptidos. Estas proteínas são codificadas em várias espécies de bactérias e possuem homólogos tanto no domínio Eukarya como no domínio Archaea. Os objectivos deste trabalho foram: i) identificar os clusters de lantipéptidos presentes no genomas de Archaea, recorrendo a bases de dados públicas, ii) caracterizar os clusters identificados e, por último, iii) identificar os padrões de desidratação e ciclização dos lantipéptidos encontrados em Haloferax mediterranei ATCC 33500. Em Archaea foram detectados apenas genes lanM, que estão confinados aos genomas de organismos pertencentes à classe Halobacteria. Uma procura “manual” in silico na região genómica de cada lanM permitiu identificar a presença de vários genes lanA. A análise da sequência dos lantipéptidos codificados por estes lanAs não identificou motivos conservados, mas permitiu a sua divisão em grupos diferentes. Os clusters que contêm estes genes também codificam proteínas de função desconhecida e transportadores ABC. Nenhum destes transportadores é do tipo SunT (LanT) que estão normalmente associados ao processamento de lantipéptidos modificados por LanMs. Haloferax mediterranei ATCC 33500 foi selecionado para uma caracterização mais aprofundada uma vez que possui três genes lanM: um no cromossoma (medM1) e dois num plasmídeo (medM2 e medM3). Foram construídos três vetores que permitiram a co-expressão dos genes medM e His6-medA em Escherichia coli. Após produção, purificação por IMAC e análise por MALDI-TOF, verificou-se que nenhum dos péptidos foi desidratado. Desta forma, as enzimas MedM não parecem estar funcionais no citoplasma de E. coli, necessitando provavelmente de elevadas concentrações de sal para exercer as suas funções. Desta forma, utilizou-se um outro hospedeiro para expressão heteróloga: a Archaea Haloferax volcanii H1424. Para tal, foram construídos novos vectores de co-expressão baseados no plasmídeo pTA1392, contendo dois promotores (e não apenas um como na versão original). Após transformação de H. volcanii, os péptidos foram produzidos e purificados por IMAC. A análise por MALDI-TOF, não revelou a presença de nenhum dos His6-MedA. Consequentemente, será necessário optimizar os protocolos de produção e/ou purificação destes péptidos de H. volcanii. O sucesso desta optimização permitirá provar a funcionalidade das enzimas MedM e estabelecer um sistema de expressão de natureza halófita que poderá ser útil para o estudo de outros clusters biosintéticos de Archaea. Concluindo, organismos do domínio Archaea, em particular Halobacteria, codificam enzimas envolvidas na biossíntese de lantipéptidos homólogas às encontradas em bactérias. Os lantipéptidos de bactérias normalmente são bacteriocinas. Se os lantipéptidos de Archaea possuírem atividade contra outras Archaea (archaeocinas), poderão ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de novos marcadores seletivos. Isto permitirá melhorar as ferramentas existentes para manipulação genética de Archaea.