Optimization of Emiliania huxleyi growth for production of n-3 polyunsaturated fatty acids and novel compounds with osteogenic activity - Maia, Inês Beatriz Castro (2019)
Emiliania huxleyi é uma das mais abundantes espécies de cocolitoforídeos (Haptophyta) e é responsável por vastos blooms em todo o mundo, sendo até visíveis do espaço. A abundância de E. huxleyi nos oceanos sugere fortemente que é uma microalga promissora para a produção industrial de larga escala, com possíveis aplicações biotecnológicas. A sua capacidade de calcificação, devido à produção de placas de calcite, sugere ainda que poderá ser usada para estudos de acidificação dos oceanos, com potencial para mitigação de CO2. E. huxleyi é um organismo unicelular com um reduzido tamanho (4-6 μm) que produz cocólitos em vesículas intracelulares especializadas. Possui também um ciclo de vida haplo-diplonte complexo, com 3 tipos celulares diferentes: células portadoras de cocólitos (células C diploides), células nuas não-móveis (células N) e células móveis portadores de escamas (células S haploides). Os diferentes tipos celulares podem ser induzidos durante o ciclo de vida, levando à diferenciação celular. O ciclo de vida haplo-diplonte tem também um papel muito importante para a sobrevivência da espécie. Esta espécie possui várias caraterísticas com interesse biotecnológico, devido à síntese de ácidos gordos polinsaturados de elevado valor comercial e à produção de pigmentos que poderão servir como substitutos de colorantes artificiais. Além disso, E. huxleyi possui ainda uma caraterística diferente de outras espécies de microalgas mais produzidas industrialmente, que é a produção de cocólitos formados por CaCO3. Estes cocólitos demonstram também grande potencial, com aplicações em nanotecnologia ou ainda como substitutos à calcite industrial. A produção de CaCO3 sugere ainda a presença de compostos com atividade osteogénica. Sete estirpes de E. huxleyi foram adquiridas, procedendo-se ao seu crescimento sob condições controladas. Das sete estirpes, a estirpe RCC1250 foi a selecionada, uma vez que foi a que respondeu melhor às condições de scale-up. Fatores abióticos importantes – meio de cultura, temperatura e intensidade luminosa – foram otimizados para a estirpe E. huxleyi RCC1250 através do uso de fotobiorreatores de escala laboratorial Algem®. Cada ensaio teve a duração de 11 dias, com a monitorização das culturas a cada 2 dias, que incluía: contagens celulares, fluorometria, determinação da concentração de NO3- e observações microscópicas. O desempenho de crescimento foi superior usando Nutribloom® como meio de cultura, quando comparado com o crescimento observado com o meio de cultura K/2, que é considerado o meio de cultura “standard” para esta espécie. A concentração de NO3- também mostrou ser crucial para o crescimento, em que o meio de cultura a uma concentração de NO3- de 0.6 mM demonstrou ser inibitório, numa fase inicial do crescimento. Com este ensaio, ficou definido que o meio de cultura Nutribloom® a uma concentração de 0.3 mM de NO3- seria adicionado no dia 0 e, quando a cultura atingisse uma densidade ótica de 1, esta concentração seria aumentada para 0.6 mM, com adição de meio de cultura a cada 2 dias. A temperatura ótima de crescimento correspondeu a 23 ºC, mas também houve crescimento aos 26 ºC, mostrando um certo nível de adaptação a temperaturas mais altas, o que será vantajoso para uma produção industrial no sul de Portugal. Determinou-se também que 900 μmol fotões/m2/s corresponde à intensidade luminosa ótima em termos de densidade de fluxo de fotões. Foi ainda possível verificar a inibição da fotossíntese em culturas expostas a intensidades luminosas superiores a 1000 μmol fotões/m2/s. As condições “standard” (meio de cultura K/2 a uma concentração de NO3- de 0.3 mM, posteriormente aumentada para 0.6 mM, 17 ºC e 1219 μmol fotões/m2/s) foram também comparadas com as condições otimizadas (meio de cultura Nutribloom® a uma concentração de NO3- de 0.3 mM, posteriormente aumentada para 0.6 mM, 23 ºC e 900 μmol fotões/m2/s), resultando num aumento de crescimento significativo. No final dos ensaios nos fotobiorreatores Algem®, a biomassa foi recolhida por centrifugação e liofilizada para a determinação da composição bioquímica de E. huxleyi. Determinou-se também o conteúdo proteico e de pigmentos, a percentagem de lípidos totais e o perfil de ácidos gordos. A biomassa produzida sob as condições standard continha elevadas quantidades de ácidos gordos saturados e monoinsaturados, nomeadamente os ácidos gordos mirístico, palmítico e oleico. No entanto, a biomassa produzida sob as condições otimizadas continha elevadas quantidades de ácidos gordos polinsaturados (PUFA), nomeadamente os ácidos octadecatetrenóico (OTA) e docosahexenóico (DHA), que são conhecidos pelo seu elevado valor comercial. Aumentaram ainda a produção dos PUFAs anteriores em 4 e 5 vezes, respetivamente. O conteúdo proteico foi também significativamente superior nas culturas expostas às condições otimizadas. Elevadas quantidades de 19’-hexanoilofucoxantina e fucoxantina foram também obtidas sob condições otimizadas, com um aumento de 3 e 2 vezes, respetivamente. O potencial osteogénico de vários extratos de E. huxleyi (etanol, acetato de etilo e água) foi avaliado em larvas de peixe-zebra (Danio rerio) com 3 dias pós-fertilização, expostas por 3 dias a várias concentrações de cada extrato. Os extratos testados não afetaram a área da cabeça das larvas, sendo este o parâmetro usado para a correção da área do opérculo. Análises morfométricas das larvas coloradas com alizarin-red revelaram que o extrato etanólico a 10 μg/mL e 1 μg/mL aumentaram, respetivamente, a área do opérculo em 20 e 11% sobre o controlo (o primeiro tão alto quanto o controlo positivo). A aplicação do extrato de acetato de etilo também levou a um aumento do opérculo em 12% a 100 μg/mL, enquanto o extrato de água não demonstrou nenhum efeito significativo no crescimento do osso. Este ensaio mostrou a presença de compostos pro-osteogénicos, com potencial para desenvolvimento de um novo fármaco. Em conclusão, o presente estudo revelou uma nova perspetiva no impacto dos fatores abióticos no crescimento de E. huxleyi RCC1250. O meio de cultura e a sua concentração de NO3- demonstrou ter um papel fundamental no crescimento desta estirpe, assim como a temperatura e a intensidade luminosa. A otimização destes parâmetros levou também a um aumento significativo na produção de compostos de elevado valor comercial, como PUFAs n-3, fucoxantina e 19’-hexanoilofucoxantina. Deste modo, este trabalho não só permitiu o estabelecimento de um novo protocolo para o melhoramento do crescimento de E. huxleyi, mas também mostrou o seu potencial como uma fonte de compostos de elevado valor comercial e de importantes metabolitos secundários com atividade osteogénica na biomassa produzida.