Characterization of two novel protein phosphatase 1 regulators : I2L and NEK2C - Wenjuan Wu (2011)
A infertilidade masculina tem vindo a assumir proporções preocupantes na nossa sociedade. Há inúmeros factores que contribuem para esta condição, incluindo problemas associados à motilidade dos espermatozóides. As bases moleculares da motilidade dos espermatozóides ainda não foi completamente desvendada, contudo a incubação de espermatozóides imaturos imóveis com inibidores de proteínas fosfatases induz a sua motilidade. A fosforilação de proteínas é, então, fundamental na regulação da motilidade dos espermatozóides. A fosforilação de proteínas é um dos principais mecanismos reguladores de cascatas de transdução de sinais em organismos eucariotas. Os mecanismos dinâmicos e reversíveis de fosforilação/desfosforilação são catalizados pelas proteínas cinases e pelas proteínas fosfatases, respectivamente. A PP1, uma fosfatase específica para serina/treonina, está envolvida no controlo da motilidade dos espermatozóides, e noutras funções nos testículos. Nas células somáticas, a PP1 está envolvida em diversos mecanismos, que incluem o controlo do ciclo celular, a contracção muscular, a expressão de genes, a actividade neuronal e o metabolismo do glicogénio. A especificidade da função da PP1 depende das proteínas reguladoras que interagem com a sua subunidade catalítica, direccionando-a para um dado substrato ou para uma determinada localização subcelular, e/ou modificando a sua actividade em relação ao substratos. Actualmente conhecem-se mais de cinquenta subunidades reguladoras da PP1, não relacionadas bioquimicamente. A diversidade da PP1 também se deve à expressão de várias isoformas: existem três genes que codificam a PP1 no genoma humano, denominados PP1α, PP1β e PP1γ. Maior complexidade advem ainda do ‘splicing’ alternativo que é conhecido para a PP1α e PP1γ. O gene da PP1γ origina uma variante ubíqua, a PP1γ1, e uma variante enriquecida em testículo, a PP1γ2, que é também a isoforma da PP1 mais abundante em espermatozóides, e que pode ser alvo de uma terapêutica para a infertilidade masculina ou contracepção. Rastreios de uma biblioteca de cDNA de testículo humano utilizando o sistema dois-híbrido de levedura foram realizados usando como iscos a PP1γ1 ou a PP1γ2. Várias novas proteínas que se ligam à PP1 foram identificadas e as respectivas interacções validadas usando uma diversidade de métodos, quer in vivo quer in vitro (utilizando PP1γ1 e PP1γ2 recombinantes produzidas em sistemas de expressão bacterianos). Nas condições testadas, ambas as variantes recombinantes da PP1γ apresentaram propriedades enzimáticas semelhantes, o que confirma que a sua especificidade funcional é provavelmente adquirida pela ligação de proteínas reguladoras. Neste trabalho iremos focar em duas proteínas que ligam a PP1 e que foram recentemente identificadas no laboratório, denominadas I2L e Nek2C. A I2L (Inhibitor 2-like) é >90% idêntica ao I2, tanto ao nível nucleotídico como ao nível da sequência de amino ácidos, e constitui uma isoforma nova do I2. Previamente tinha sido identificada como um pseudogene, no entanto apresentamos evidências que apoiam a sua expressão no testículo. A ausência da Thr-73 da I2L é muito significativa e pode ter consequências fisiológicas importantes. Esta ausência resulta numa inibição permanente da actividade da PP1γ2 pela I2L, promovendo potencialmente o desenvolvimento unidireccional da motilidade à medida que os espermtozóides viajam através do epidídimo. A Nek2C é uma nova variante de ‘splicing’ da Nek2A, diferenciando-se apenas pela ausência de 8 aminoácidos Nterminais à sequência consenso de ligação à PP1. Contudo a falta destes 8 aminoácidos tem consequências evidentes, resultando na expressão funcional de um NLS (sinal de localização nuclear). Deste modo, o mecanismo de ‘splice’ alternativo controla a translocação nuclear desta proteína cinase reguladora do ciclo celular, fornecendo um mecanismo pouco usual de modulação da localização da Nek2 e permitindo que a cinase desempenhe funções tanto nucleares como citoplamáticas. A PP1 encontra-se também em ambos os locais, regulando uma enorme variedade de processos celulares. No futuro espera-se que o presente trabalho possa contribuir para uma melhor compreensão dos eventos moleculares envolvidos no controlo da motilidade dos espermatozóides e na fertilização. Estas proteínas que interagem com a PP1 podem constituir alvos para interferir com diferentes funções específicas da PP1. Tanto a I2L como a Nek2C exibem características únicas, podendo constituir candidatos interessantes para futuros desenvolvimento no âmbito do diagnóstico e terapêutica baseadas na transdução de sinais para a contracepção e para o tratamento da infertilidade masculina.