Inativação fotodinâmica de endósporos bacterianos: aplicação de alta pressão como coadjuvante na ligação de fotossensibilizador - Couceiro, Joana Duarte Baptista (2018)
Os endósporos bacterianos representam riscos significativos em muitas atividades humanas, pelo que é fundamental descobrir formas de inativar estas estruturas. A terapia fotodinâmica (PDT) têm-se revelado uma alternativa promissora para inativar microrganismos patogénicos. Com este trabalho pretendeu-se avaliar o efeito da alta pressão como coadjuvante do efeito fotodinâmico, na inativação de endósporos de Bacillus cereus, usados como modelo biológico de endósporos bacterianos. Endósporos de B. cereus foram preparados em meios de esporulação e conservados a -20 °C até à realização dos ensaios. Como fotossensibilizador (PS), utilizou-se uma porfirina tetracatiónica (Tetra-Py+-Me), aplicada nas concentrações de 5 e 20 M. Os endósporos foram incubados durante 30 min a 37 °C no escuro, na presença de PS, para permitir a adsorção do PS ao material do endósporo. A potência da luz branca usada na irradiação foi 1690 W.m-2. O efeito dos vários tratamentos foi avaliado por comparação dos resultados com os valores iniciais da concentração de endósporos viáveis na suspensão não tratada. As variáveis em estudo foram a concentração de PS, a pressão aplicada, a temperatura de incubação e o tempo de exposição à luz branca. Em cada experiência foram incluídos os seguintes controlos: controlo claro (exposto à luz sem PS), controlo escuro (com PS mas não irradiado), controlo de pressão (pressurizado sem PS e não irradiado) e controlo escuro pressurizado (exposição ao PS a 300 MPa, sem exposição à luz). A concentração de endósporos viáveis antes e depois de cada tratamento foi determinada por contagem de colónias após sementeira em meio sólido. O tempo de congelação do stock de endósporos afetou a adsorção de PS. Alíquotas com períodos de armazenamento a - 20 °C, entre 15 e 43 dias, produziram valores de adsorção de PS entre 3,63×105 e 8,01×105 moléculas de PS.UFC-1, quando expostas a 5 μM de PS. O aumento da temperatura de préincubação no escuro de 37 para 50 °C, resultou no aumento da quantidade de PS adsorvido de 13,1×105 para 26,3×105 moléculas de PS.UFC-1, na presença de 5 μM de PS. A aplicação de pressão (300 MPa, durante 30 minutos) resultou num aumento de 30 a 90% na quantidade de PS ligado aos endósporos nas experiências realizadas com 5 μM de PS. Com 20 μM de PS, os valores de adsorção com pressurização foram 2,3 a 76,1 vezes superiores aos obtidos com pré-exposição ao PS à pressão atmosférica. Os fatores de inativação máximos foram registados para o tratamento correspondente à aplicação de pressão durante o período adsorção do PS, e variou entre 1,1 e 2,4 log. Embora os fatores de inativação obtidos sejam ainda modestos, os resultados demonstram que a aplicação de alta pressão melhora a ligação do PS aos endósporos e pode funcionar como um fator coadjuvante da inativação fotodinâmica de endósporos bacterianos.