Identification of oxidation products of cardiolipin using mass spectrometry - Maciel, Maria Elisabete Alves (2011)
Cardiolipina (CL) é um fosfolípido de estrutura complexa, que se encontra quase exclusivamente na membrana interna da mitocôndria, onde se encontra associada a diferentes complexos da cadeia respiratória. Pela sua localização, este fosfolípido desempenha um importante papel no metabolismo energético mitocôndrial. Alterações na cardiolipina nomeadamente por modificações oxidativas têm sido relacionadas com a apoptose celular e com várias condições patológicas, particularmente nas doenças neurodegenerativas. A estrutura da CL apresenta quatro cadeias de ácidos gordos que podem diversificar no comprimento e no grau de insaturação, é muito susceptível a danos oxidativos por espécies reactivas de oxigénio (ROS). A sua localização, na mitocôndria aumenta a probabilidade desta sofrer oxidação, uma vez que existe uma considerável produção de ROS na membrana interna mitocôndrial. ROS estão envolvidas no stress oxidativo em diferentes biomoleculas, nomeadamente nos lípidos, levando a modificações na sua estrutura e consequentemente, à perda da sua função. Apesar da importância da oxidação da CL e das suas possíveis consequências biológicas, existe um conhecimento limitado em relação aos produtos de oxidação formados em condições de stress oxidativo. Neste estudo, a espectrometria de massa e a espectrometria de massa acoplada à cromatografia liquida (LC-ESI-MS) foram utilizados para identificar modificações oxidativas especificas da etra-linoleoil CL induzidas pelo radical hidroxilo através da reacção de Fenton (H2O2 and Fe2+). Os resultados obtidos neste estudo permitiram identificar pela primeira vez diversos produtos de oxidação de cadeia curta e também outros de cadeia longa durante a oxidação da CL. Os produtos de oxidação de cadeia curta resultam de uma clivagem do ácido gordo oxidado, conduzindo á formação de ácido gordos de cadeia curta com terminal aldeído, e ácidos dicarboxilico, observados em MS na forma de iões [M-H]- e [M-2H]2-. Estes resultados permitiram detectar alguns destes produtos de oxidação na mitocôndria dos rins dos ratos tratados com gentamicina, com nefropatia confirmada. A identificação detalhada da fragmentação dos produtos de cadeia longa por LC-MS/MS permitiu a diferenciação de isómeros, e a identificação do local de oxidação para CL com 2, 4, 6 e 8 átomos de oxigénios. Este trabalho permitiu identificação de iões produto específicos que permitem a sua atribuição inequívoca, que será fundamental para a identificação destas espécies em amostras biológicas. ABSTRACT: Cardiolipin (CL) is a phospholipid with a complex structure, found almost exclusively in the inner mitochondrial membrane, where it is found associated with several different complexes of the respiratory chain. Because of its localization, this phospholipid performs an important role in the mitocôndrial energetic metabolism. Alteration of CL namely by oxidative modifications has been related with various pathological conditions, particularly in neurodegenerative diseases. CL structure bears four chains of fatty acids that can diversify in length and degree of unsaturation; it is susceptible to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS). Their location, in the mitochondria, makes them even more likely to be oxidized, since that there is a considerable production of ROS in the inner mitochondrial membrane. ROS are involved in oxidative stress modifications of different biomolecules, namely lipids, leading to changes in their structure and in consequence, loss of their function. In spite of the importance of CL oxidation and it biological consequence, there is a limited knowledge of the oxidation products of CL formed under oxidative stress. In this study, mass spectrometry and mass spectrometry coupled with liquid chromatography (LC-MS) was used to identify the specific oxidative modifications of tetra-linoleoyl CL induced by the hydroxyl radical generated under Fenton reaction conditions (H2O2 and Fe2+). The results obtained with this study allowed us to identify, for the first time, several short chain oxidation products along with some long chain products during the oxidation of CL. Short-chain oxidation products resulted from a cleavage of the oxidized fatty acid, leading to the formation of short chain fatty acids with aldehyde terminal, and dicarboxylic acids, observed in MS in the form of the ions [M-H]- and [M- 2H]2-. These results allowed us to detect some of these oxidation products in the mitochondria of kidneys obtained from rats treated with gentamicin, with confirmed nephropathy. The detailed identification of the fragmentation of the long chain products by LC-MS/MS allowed us to differentiate isomers, and the identification of the oxidation location for the CL with 2, 4, 6 and 8 oxygen atoms. This work allowed the identification of specific product ions which allow their unequivocal assignment that will be paramount for the identification of these species in biological samples.