Induction and determination of ROS and their effect on peroxisome dynamics - Pinho, Sónia Andreia de Almeida (2012)
Peroxissomas são organelos celulares de membrana simples, os quais têm importantes funções metabólicas, como por exemplo metabolismo de lípidos e ROS, sendo assim indispensáveis para a saúde e desenvolvimento humano. Os peroxissomas são organelos altamente flexíveis e dinâmicos que rapidamente se agregam, multiplicam e degradam em resposta a necessidades metabólicas. Em cultura celular, o stress oxidativo e outros estímulos externos (ex. factores de crescimento, ácidos gordos, despolimerização) têm mostrado induzir processos de crescimento (alongamento) e divisão de peroxissomas, os quais estão relacionados com a sua proliferação. Considerando que alguns dos componentes moleculares da maquinaria de crescimento e divisão têm sido identificados nos últimos anos, as vias de sinalização e regulação que medeiam a proliferação de peroxissomas são largamente desconhecidas. O objectivo desta dissertação de mestrado foi examinar o efeito de diferentes estímulos externos promotores de ROS na indução do crescimento/proliferação do compartimento peroxisomal. Foi seleccionado um sistema de cultura de células de mamífero que apresentam um compartimento peroxisomal dinâmico. Análises baseadas em fluorescência para a detecção da produção de ROS e alterações nos níveis de GSH intracelular foram estabelecidos. Estes procedimentos foram usados primeiro para esclarecer se o alongamento de peroxissomas observado após despolimerização de microtubulos (pelo nocodazole) é mediado por ROS. O alongamento de peroxissomas e a despolimerização dos microtubulos após tratamento com nocodazole foi monitorizado e quantificado por microscopia de imunofluorescência. O Nocodazole induziu um aumento dos níveis de ROS intracelular e apesar do pré tratamento com antioxidantes ter baixado os níveis de ROS, não preveniu o alongamento peroxisomal. Estes resultados demonstram que as alterações morfológicas do compartimento peroxisomal induzidas pelo nocodazole são independentes da produção de ROS. Para além disso, foi examinado o efeito de alterações nos níveis de glutationa (GSH) celular no compartimento peroxisomal. Interessantemente, a redução dos níveis de GSH intracelular pelo BSO, um inibidor da enzima γ-glutamylcystein synthetase (γ-GCS), resultou num aumento acentuado de crescimento/proliferação de peroxissomas. Os níveis de ROS e GSH foram determinados por análises baseadas em fluorescência. Pré tratamento com antioxidante preveniu o alongamento de peroxissomas indicando que a alteração no estado redox celular (citoplasmatico) levou à proliferação de peroxissomas a qual exerce, supostamente, uma função protectora para a célula. Finalmente, foi investigado se a inibição da cadeia respiratória mitocondrial e com isso, se ROS provenientes das mitocondrias foi capaz de induzir crescimento e divisão dos peroxissomas. Entre os inibidores analisados, apenas a rotenona, inibidor do complexo I, teve um efeito proeminente na elongação de peroxissomas. Todavia, foi demontrado que o seu efeito é devido à acção que a rotenona tem na despolimerização dos microtubulos. Assim, apesar da relação de proximidade entre mitocondria e peroxissomas, as ROS provenientes das mitocondrias não são prováveis de induzir alterações no compartimento peroxisomal. Os nossos resultados também indicam que estudos in vivo usando a rotenona têm de ser interpretados com muito cuidado. Além disso, os resultados mostram que as ROS podem alterar a dinâmica do compartimento peroxissomal, mas têm de vir de locais específicos dentro da célula (por exemplo, do citosol). ABSTRACT: Peroxisomes are single membrane bound subcellular organelles, which fulfill important metabolic functions, for example in lipid and ROS metabolism, and are thus indispensable for human health and development. Peroxisomes are highly flexible organelles that rapidly assemble, multiply and degrade in response to metabolic needs. In cultured cells, oxidative stress and other external stimuli (e. g. growth factors, fatty acids, microtubule depolymerization) have been shown to induce processes of growth (elongation) and division of peroxisomes, which are related to peroxisome proliferation. Whereas some of the molecular components of the growth and division machinery have been identified in the last years, the regulatory and signaling pathways mediating peroxisome proliferation are largely unknown. The aim of this master thesis was to examine the effects of different ROS-producing external stimuli on the induction of growth/proliferation of the peroxisomal compartment. A suitable mammalian cell culture system with a dynamic peroxisomal compartment was selected and fluorescent-based assays for the detection of ROS production and changes in the intracellular GSH levels were established. The setup was first used to clarify if peroxisome elongation observed after depolymerization of microtubules (by nocodazole) is mediated by ROS. Peroxisome elongation and microtubule depolymerization after nocodazole treatment was monitored and quantified by immunofluorescence microscopy. Although nocodazole induced an increase in cellular ROS levels, a pre-treatment with antioxidants and lowering of intracellular ROS levels did not prevent peroxisome elongation. These findings demonstrate that the morphological changes of the peroxisomal compartment induced by nocodazole are independent of ROS production. Furthermore, I examined the effect of changes in the cellular redox state on the peroxisomal compartment. Interestingly, the reduction of intracellular GSH levels by BSO, an inhibitor of γ- glutamylcystein synthetase (γ-GCS), resulted in a prominent increase in peroxisomal growth/elongation. ROS and GSH levels were determined by fluorescent-based assays. Pre-treatment with antioxidants prevented peroxisome elongation indicating that changes in the cellular (cytoplasmic) redox state lead to peroxisome proliferation, which is supposed to have a protective function for the cell. Finally, I investigated whether inhibition of the mitochondrial respiratory chain and thus, mitochondriaderived ROS were capable of inducing peroxisomal growth and division. Among the inhibitors tested, only rotenone, a complex I inhibitor, had a prominent effect on peroxisome elongation. However, I demonstrated that this effect is due to a microtubule-depolymerizing activity of rotenone. Thus, despite the close peroxisomemitochondria relationship, mitochondria-derived ROS are unlikely to induce changes of the peroxisomal compartment. Our findings also indicate that in vivo studies using rotenone have to be interpreted with great care. In addition, the results show that ROS can alter the dynamics of the peroxisomal compartment, but have to come from specific locations (e.g. the cytosol) within the cell.