Use of immunohistochemical techniques to investigate museum specimens of neurological disease - Monteiro, Susana Isabel Gonçalves (2011)
Os espécimes de museu são um recurso valioso tanto para o ensino como para a investigação, mas geralmente têm sido utilizados para demonstrar a morfologia macroscópica. O objectivo da presente dissertação é determinar se modernas técnicas neuropatológicas, tal como a histologia e a imunohistoquímica, podem ser aplicadas com sucesso a espécimes de museu preservados por períodos superiores a 50 anos. Poderá ser esperado que a qualidade do material histológico recuperado de espécimes de museu seja afectada por vários factores. Estes incluem a idade do espécime, o tipo e a duração da fixação/preservação, condições do acondicionamento do espécime, informação relativa ao paciente e o período post-mortem. É importante compreender como é que os métodos de preservação mudaram com o passar dos tempos, consequentemente uma breve revisão desta história foi feita. É descrito o processo de selecção dos espécimes para este estudo e é apresentada uma investigação às características das diferentes soluções de montagem. Grande parte desta dissertação refere-se ao desenvolvimento de formas que permitam a aplicação de técnicas histológicas modernas a espécimes de museu. É demonstrado que uma pós-fixação em formaldeído 10% e um ajuste do pH da solução corante de eosina para um intervalo entre 4.8 e 5.0, são especialmente importantes em tecidos envelhecidos. Foi obtida uma coloração imunohistoquímica satisfactória utilizando o sistema EnVision+ (Dako), um polímero acoplado com HRP, com o anticorpo anti-neurofilamento (Dako). No entanto, apenas alcançou-se resultados satisfatórios com cortes de crióstato, os quais, aparentemente, produzem melhor coloração imunohistoquímica quando comparados com cortes de tecidos fixados em formaldeído e incluídos em parafina (FFPE), sugerindo assim, que o processamento em solventes orgânicos e as altas temperaturas da parafina derretida alteram a conformação do antigénio impedindo a detecção imunohistoquímica. Um estudo detalhado de três casos datados de 1953, 1954 e 1955 confirma que técnicas modernas (incluíndo imunohistoquímica) podem ser utilizadas em tecidos envelhecidos a um ponto de serem consideradas diagnosticamente válidas. Este estudo demonstra que com ajustes cuidados aos protocolos é possível obter-se notáveis resultados histológicos de alta qualidade em tecidos que foram preservados por muitos anos. Confirma também, que espécimes de museu representam um valioso recurso para ensino e para a investigação a um nível ultraestrutural. ABSTRACT: Museum Specimens are a valuable resource both for teaching and research but have generally been used to show the gross morphology. The aim of this dissertation is to determine if modern neuropathological techniques, such as histology and immunohistochemistry, can be applied successfully in museum specimens that have been preserved for periods in excess of 50 years. It may be expected that many factors could affect the quality of histological material retrieved from museum specimens. These include the age of the specimen, type and length of fixation/preservation, storage conditions, patient information and post-mortem period. It is important to understand how preservation methods had changed over time, and therefore, the complex history of “potting” is reviewed. The process of selecting specimens for this study is described and an investigation into the characteristics of mounting solutions is presented. The major part of the dissertation concerns the development of ways in which to apply modern histological techniques to museum specimens. It is shown that post-fixation in formaldehyde 10% and an adjustment of the eosin stain solution to a pH ranging between 4.8 and 5.0 are especially important in older tissues. Satisfactory immunohistochemistry staining was obtained using EnVision + (Dako) system, a HRP labeled polymer, with anti-neurofilament antibody (Dako). Nevertheless, successful results were only achieved with cryostat sections, as they appeared to produce better immunohistochemistry staining when compared to formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections, suggesting that processing in organic solvents and high temperatures of molten paraffin alters the conformation of the antigen hampering immunohistochemistry detection. A detailed study of three cases from 1953, 1954 and 1955 confirms that modern techniques (including immunohistochemistry) can be used in aged tissue to the point where they are useful diagnostically. This study shows that with careful adjustment to protocols it is possible to achieve remarkably high quality histological results in tissues that have been preserved for many years. It confirms that specimens in museums represent a valuable resource for teaching and research at an ultrastructural level.