I-2L, a novel putative PP1 inhibitor in human sperm - Ferreira, Mónica Alexandra dos Santos (2012)
A proteína fosfatase-1 (PP1) é uma proteína fosfatase ubíqua e específica para a desfosforilação de resíduos de serina e treonina, que participa na regulação de diversos processos celulares. Em mamíferos, a actividade da PP1 está relacionada com a motilidade dos espermatozóides durante o percurso no tracto epididimal. Esta holoenzima é composta por uma subunidade catalítica, denominada PP1c, e por proteínas que interagem com a PP1 (PIPs) e a dirigem para a proximidade de substratos, determinando a sua actividade. A PP1 é codificada por três genes distintos: PP1α, PP1β e PP1γ. As isoformas PP1γ1 e PP1γ2 são originadas por splicing alternativo do gene PP1γ. PP1γ1 é uma isoforma ubíqua e a PP1γ2 é expressa maioritariamente no testículo e espermatozóides. O inhibidor-2 (I-2) de mamífero é uma PIP ancestral que se liga à PP1c, resultando na inibição da actividade da PP1. A reactivação deste complexo é desencadeada pela desfosforilação do I-2 no resíduo de Thr73 pela GSK-3. Atendendo às diversas funções que têm sido atribuídas à PP1, com base nas suas subunidades reguladoras, é crucial identificar novas PIPs. Assim, com o objectivo de identificar novas PIPs em testículo humano, procedeu-se ao rastreio de uma biblioteca de cDNA de testículo humano pelo método de dois híbrido de levedura, usando a PP1γ1 e PP1γ2 como isco. Foi assim obtido um clone muito semelhante ao I-2, denominado I-2L. Após um estudo comparativo por análise bioinformática, a principal diferença detectada foi a substituição de um resíduo de Thr73 por um de Pro73, no I-2L, conduzindo à ausência do local de fosforilação pela GSK-3, o que resulta num novo mecanismo de regulação para o complexo PP1γ2-I-2L. A presença de I-2/I-2L em espermatozóides humanos foi confirmada pelos métodos de Western blot e imunocitoquímica. As proteínas I-2/I-2L e a PP1γ2 co-localizam na peça intermédia e principal do flagelo dos espermatozóides, em concordância com o papel do complexo PP1γ2-(I-2/I-2L) na motilidade dos espermatozóides. A semelhança entre o I-2 e I-2L, em termos da sequência de aminoácidos (95%), origina um novo desafio na diferenciação destas duas proteínas. Consequentemente, foi analisado o fingerprint proteolítico do I-2 e I-2L para posterior análise por espectrometria de massa, sendo esta uma abordagem eficaz para provar a existência do I-2L in vivo. Estudos estão presentemente a decorrer no sentido de validar, por espectrometria de massa, a sequência de aminoácidos do I-2L imunoprecipitado de espermatozóides humanos.