Doença dos legionários : estudo da diversidade de isolados de legionella obtidos em Portugal, 1987-2016 - Chasqueira, Maria de Jesus Fernandes (2020)
RESUMO: O trabalho desenvolvido dividiu-se em duas áreas do conhecimento do género Legionella: a epidemiologia e a interação bactéria-hospedeiro natural. Estudou-se a epidemiologia da Doença dos Legionários em Portugal, no período entre 1987 e 2016, analisando 205 isolados, 178 dos quais recuperados de doentes com formas graves de pneumonia e 27 de amostras ambientais. Entre os isolados clínicos, 130 foram enviados através do Programa de Vigilância Epidemiológica Integrada da Doença dos Legionários e 48 foram recuperados num hospital da área de Lisboa, com vários casos de infeção hospitalar durante 21 anos e em cuja água do sistema de distribuição foi sistematicamente isolada a bactéria. Na tipificação destes isolados, utilizaram-se duas metodologias preconizadas pelo Grupo Europeu, anticorpos monoclonais (MAbs) do Painel de Dresden e a tipificação baseada em sequências (SBT). No grupo dos isolados provenientes de casos de infeção hospitalar foram aplicados mais dois métodos, o que avalia os polimorfismos de fragmentos amplificados por PCR (AFLP) e a sequenciação total do genoma (WGS). Os resultados da tipificação mostraram que todos os isolados pertencem à espécie Legionella pneumophila e maioritariamente ao serogrupo 1, e que todos, à exceção de um, reagem com o monoclonal MAb3/1. Na tipificação baseada em sequências, identificaram-se 39 perfis diferentes, 16 dos quais são novos, isto é, nunca antes identificados. Na sequenciação total do genoma, dos 48 isolados provenientes de infeção hospitalar, foi possível agrupá-los num mesmo clone, com uma microevolução marcada essencialmente pela fixação de mutações pontuais. Entre os isolados foi possível identificar três sub-linhagens, com base no número de diferenças nucleotídicas. A caracterização feita diretamente nas amostras clínicas por uma técnica de nested PCR permitiu a identificação de alguns alelos, verificando-se que só em amostras provenientes de sobrenadantes de culturas de amibas foi detetado o perfil alélico completo. Foi ainda efetuado o estudo da relação filogenética entre os perfis alélicos identificados em Portugal e os reportados à Base de dados Europeia por outros países. A população de Legionella responsável por casos de doença em Portugal é constituída por uma mistura de perfis específicos (exclusivos de Portugal) e de perfis comuns a outros países, tendo-se verificado nesta avaliação que 34 dos perfis têm relação com, pelo menos, um perfil dos existentes na referida Base. Na segunda parte desta tese, desenvolveu-se o estudo da interação Legionella-hospedeiro natural, tendo-se utilizado a espécie Acanthamoeba castellanii. Avaliaram-se as taxas de internalização e multiplicação às 4, 14 e 22h, a sensibilidade ao sódio e ao choque osmótico com potássio, e ainda, o transcritoma da bactéria, 22 horas após o início da co-cultura. Os resultados mostraram especificidade em relação às duas estirpes utilizadas e, embora estas apresentem neste momento do seu ciclo de vida um fenótipo característico de fase transmissível, verificou-se que o padrão de expressão génica é semelhante ao evidenciado por outras estirpes, na fase replicativa, sugerindo que a Legionella na fase final do seu ciclo de multiplicação intracelular, já está a preparar a próxima fase replicativa.