Isolamento e caracterização das células da notocorda humana: Implicações para o desenvolvimento de terapias celulares para a doença degenerativa discal - Rodrigues-Pinto,Ricardo (2013)
Introdução: Para o desenvolvimento de terapêuticas celulares para o tratamento da degeneração do disco intervertebral é necessário o conhecimento detalhado das células que o constituem e das vias moleculares que levam à sua diferenciação. O núcleo pulposo (NP) embrionário, fetal e dos primeiros anos de vida é formado por células grandes e vacuoladas da notocorda; no entanto, com a maturidade esquelética, as células da notocorda desaparecem e são substituídas por células menores, semelhantes a condrócitos. Estudos animais e in vitro demonstraram que as células da notocorda exercem efeitos anabólicos e protetores sobre o disco intervertebral, pelo que o seu desaparecimento do NP humano tem sido implicado na patogénese da degeneração discal. Deste modo, o estudo destas células e dos seus mecanismos de regulação poderá identificar fatores envolvidos na homeostasia do disco intervertebral e ajudar no desenvolvimento de terapêuticas celulares para regenerar ou substituir as células do disco intervertebral degenerado. No entanto, o estudo de células da notocorda humana tem sido dificultado por restrições éticas, logísticas e técnicas, o que constitui uma importante limitação para o avanço científico nesta área. Este estudo foi realizado com o objetivo de isolar células da notocorda (precursoras do NP) das do esclerótomo (precursoras do anel fibroso (AF) e das vértebras) a partir de embriões e fetos humanos e caracterizar o seu fenótipo e os mecanismos ou moléculas reguladores da sua função no disco intervertebral. Métodos: Embriões e fetos humanos (3.5 a 12 semanas pósconceção) foram dissecados e caracterizados morfologicamente para confirmar a presença de células da notocorda na coluna vertebral em desenvolvimento. Uma vez que nesta altura do desenvolvimento humano não existe uma demarcação óbvia dos limites entre o NP, o AF e o corpo vertebral, foi desenvolvida uma estratégia baseada na identificação de um marcador celular específico para as células da notocorda e na sua utilização para as separar das células do esclerótomo. Para identificar esse marcador realizou-se uma pesquisa da literatura; seguidamente, os potenciais marcadores foram testados por imunohistoquímica em secções embrionárias e fetais contendo células da notocorda. Após identificação do marcador a usar, e uma vez que esse tinha localização intracelular, foi desenvolvida uma metodologia que permitisse extrair RNA a partir de um número limitado de células fixadas, permeabilizadas, marcadas com um anticorpo fluorescente e separadas por citometria de fluxo. O método desenvolvido foi então utilizado para separar e extrair RNA a partir de células da notocorda e esclerótomo fetais. A precisão da separação foi confirmada pela quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) da expressão de genes da notocorda nos dois tipos celulares separados. Posteriormente, microarrays foram utilizados para identificar o fenótipo e o software interactive pathway analysis (IPA®) foi utilizado para identificar moléculas e fatores reguladores da função das células da notocorda. Resultados: A coluna vertebral fetal humana foi validada como uma fonte adequada para obtenção de células da notocorda. A pesquisa da literatura identificou 16 potenciais marcadores específicos destas células e a validação de um grupo deles identificou as moléculas KRT8, KRT18 e KRT19 como sendo específicas para as células da notocorda da coluna vertebral fetal humana. Verificou-se que uma metodologia consistindo na fixação e permeabilização de células com 95% etanol/ 5% ácido acético, marcação com um anticorpo fluorescente anti-KRT18 e separação por citometria de fluxo permitia obter RNA de elevada qualidade. Esse método foi utilizado para separar células extraídas enzimaticamente da coluna fetal humana e separar as células da notocorda (precursoras do NP e KRT18-positivas) das células do esclerótomo (precursoras do AF e das vértebras e KRT18-negativas). A maior expressão diferencial dos genes da notocorda KRT18, KRT19, brachyury, Galectin 3, CTGF e FOXA2 pelas células KRT18-positivas confirmou a precisão da separação. A análise dos dois tipos celulares por microarrays identificou 782 genes regulados positivamente e 678 regulados negativamente pelas células da notocorda. A análise IPA identificou 30 moléculas reguladoras dos genes expressos pelas células da notocorda. Destas, o hepatocyte growth fator (HGF) foi identificado como o principal fator de crescimento a montante das células da notocorda ativando genes importantes para a sua função no disco intervertebral. Discussão: Este estudo isolou pela primeira vez células da notocorda humana. Para o realizar foi desenvolvida uma metodologia complexa, cujas aplicações se estendem para lá desta área de investigação. A análise por microarrays identificou marcadores fenotípicos das células da notocorda, alguns dos quais potencialmente responsáveis pelos seus efeitos protetores no disco intervertebral. O fator de crescimento HGF foi identificado como um regulador destas células, podendo ser responsável por algumas das funções que lhes são atribuídas.