Selecção de estirpes de leveduras para o rearranque de fermentações amuadas - Santos, Júlia Margarida Raposo Monteiro dos (2011)
Tendo como objectivo, do presente trabalho, a selecção de estirpes capazes de relançarem uma fermentação amuada e converterem o açúcar residual em etanol, foram estudadas várias estirpes vínicas comerciais de Saccharomyces cerevisiae, uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae laboratorial e estirpes não Saccharomyces. As estirpes foram caracterizadas no que respeita ao seu perfil de resposta a diferentes condições do meio (presença de etanol e/ou ácido acético e fonte de azoto), normalmente associadas ao atraso e paragem da fermentação vinária. Da avaliação da resposta das estirpes em estudo, quanto à concentração da fonte de azoto, verificou-se que a concentração mínima requerida por estas estirpes para o esgotamento total de açúcar presente no meio, num tempo considerado normal, foi de 267 mg/L de azoto assimilável. A caracterização da resposta à presença de etanol e ácido acético, por análise da sobrevivência celular, avaliada por contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFC), permitiu verificar que as estirpes Zygosaccharomyces bailii e Torulaspora delbrueckii foram as mais resistentes, seguidas por duas estirpes de Saccharomyces cerevisiae. As estirpes com melhor desempenho foram em seguida testadas na capacidade de consumo de frutose em meio contendo 25 g/l frutose, 12% (v/v) etanol e 0,06% (v/v) ácido acético, que simula o mosto amuado. As estirpes comerciais de S. cerevisiae foram as mais eficientes no consumo de frutose, mostrando que não existe uma correlação directa entre perda de viabilidade na presença de etanol e ácido acético e a capacidade de consumir frutose na presença destes agentes de stresse. Para a selecção das condições de adaptação mais adequadas para um melhor desempenho no mosto simulado, foram efectuadas experiências de adaptações com uma estirpe de S. cerevisiae, em diferentes estados fisiológicos com ou sem adaptação prévia ao etanol. Estas experiências demonstraram que uma adaptação prévia apenas melhorou o desempenho em células em fase exponencial de crescimento, verificando-se que os melhores resultados foram obtidos com uma adaptação a concentrações moderadas de etanol durante 2 horas. A capacidade de transporte do açúcar da estirpe de S. cerevisiae foi avaliada na presença e na ausência de etanol, e utilizando células nas mesmas fases de crescimento e condições de adaptação usadas nos ensaios de consumo de frutose. Observou-se uma correlação entre consumo de frutose e transporte de glucose na presença e ausência de etanol apenas para células em fase exponencial. Para as células em fase estacionária e em fase exponencial previamente adaptadas a etanol, as diferenças observadas para o transporte de glucose na presença ou ausência de etanol, não se reflectiram nas taxas de consumo de frutose, sugerindo que nestas células outros factores influenciam o consumo de açúcar. Na tentativa de averiguar se as diferenças de sensibilidade do transporte de glucose encontradas em células provenientes de culturas em diferentes fases de crescimento poderiam estar relacionadas com a expressão de diferentes transportadores foi estudada a inibição do transporte de glucose pelo etanol, em estirpes de S. cerevisiae que expressam unicamente um dos transportadores de glucose com relevância fisiológica (Hxt1-Hxt7). Os transportadores de glucose apresentaram diferentes percentagens de inibição do transporte na presença de etanol, tendo os transportadores Hxt4 e Hxt5 demonstrado ainda diferentes graus de inibição consuante a fase de crescimento. Tendo em conta os padrões de expressão descritos para os diferentes transportadores de glucose ao longo de uma curva de crescimento, não foi encontrada uma correlação directa entre a inibição do transporte de glucose pelo etanol observada quando os transportadores de glucose foram expressos individualmente, e as diferenças de inibição do transporte de açúcar encontradas nas células da estirpe comercial de S. cerevisiae estudada, em diferentes fases de crescimento. ABSTRACT: The aim of the present work was the selection of yeast strains capable of re-starting sluggish fermentations and converting the residual fructose to ethanol. To this aim, we first evaluated a group of yeasts comprising commercial wine strains, non-commercial Saccharomyces and non-Saccharomyces, by characterizing the response of these strains to different medium conditions (presence of ethanol and/or acetic acid, and nitrogen source) known to contribute to slow down the vinification process. By evaluation of the strain's response to the concentration of the nitrogen source, we observed that the minimal nitrogen concentration required to attain complete dryness of sugar within a reasonable time, was 267 mg/L of assimilable nitrogen. The characterization of the strain’s response to the presence of ethanol and acetic acid was evaluated by CFU counts in viability assays, and allowed to verify that the most resistant strains were Zygosaccharomyces bailii and Torulaspora delbrueckii followed by two of the commercial S. cerevisiaestrains. The best performing strains were further tested for their capacity to consume fructose in medium containing 25 g/l fructose, 12% (v/v) ethanol and 0,06% (v/v) acetic acid. Commercial S. cerevisiae strains were the most efficient, showing that there was no direct correlation between the loss of viability in the presence of ethanol and acetic acid and the capacity to ferment fructose under aggressive conditions. Ethanol adaptation experiences were made using a S. cerevisiae strain for the selection of adequate adaptation conditions to improve the performance of this strain in synthetic must. These experiences demonstrated that a previous adaptation to ethanol only improved the performance of exponential growing cells. The best results were obtained with moderate concentrations of ethanol during short times (2 hours) of adaptation. The sugar transport capacity of S. cerevisiae, was evaluated in the presence and in the absence of ethanol, using cells in the same growth phase and adaptation conditions as those used in the fructose consumption assays. For S. cerevisiae a relation between fructose consumption and glucose transport in the presence or absence of ethanol was observed only in exponential growing cells. For stationary phase cells and adapted cells the differences observed for glucose uptake rates, either in the presence or in the absence of ethanol were not expressed in fructose consumption rates, suggesting that in these cells other factors are influencing sugar consumption. To verify if the differences found in glucose uptake for cells in different growth phases could be related with the expression of different glucose transporters, inhibition of glucose uptake by ethanol was studied in S. cerevisiae strains expressing each of the major hexose transporters (Hxt1-Hxt7). The individual glucose transporters exhibited different inhibition percentages of transport in the presence of ethanol. The transporters Hxt4 and Hxt5 showed different degrees of inhibition depending on the growth phase. Based on the expression patterns described for the different glucose transporters during a growth curve a direct correlation between glucose transport inhibition of the different transporters in the presence of ethanol and the transport inhibition exhibited by the commercial S. cerevisiae strain at different growth phases, was not found.