| Summary: | A reutilização de águas residuais tratadas tem sido incentivada em todo o mundo, em particular para irrigação agrícola, porque pode ser uma fonte de água confiável e importante, principalmente em países sob estresse hídrico. Ainda se sabe pouco sobre os riscos associados à utilização de águas residuais tratadas, designadamente no que se refere à disseminação de bactérias resistentes a antibióticos (ARB) e genes de resistência a antibióticos (ARGs). Uma das principais consequências da disseminação através da irrigação agrícola utilizando águas residuais tratadas é a contaminação da cadeia alimentar humana. Atualmente, o conhecimento sobre a transmissão de ARB e ARGs para seres humanos a partir de fontes ambientais é escasso. No entanto, a reutilização de águas residuais surge como uma fonte potencial de transmissão direta ou indireta, principalmente através da cadeia alimentar humana. Esta tese explorou estas questões com base em pesquisa bibliográfica e em abordagens experimentais. O estudo foi planeado com o objetivo de inferir se as bactérias que sobrevivem nas águas residuais serão capazes de colonizar as plantas e se ARB isoladas de águas residuais e os respectivos ARGs poderiam persistir na presença da microbiota fecal autóctone de um indivíduo saudável. As hipóteses propostas para este trabalho foram as de que: 1) ARB e ARGs isoladas de águas residuais tratadas podem colonizar plantas e, eventualmente, estabelecer-se como endófitos; 2) ARGs de ARB isoladas de água residual tratada podem persistir na presença da microbiota fecal de um humano saudável. O argumento que suporta esta duas hipóteses é o de que, se ingeridas através de vegetais, as ARB e ARGs poderiam persistir no intestino humano. Utilizaram-se três abordagens principais para testar as hipóteses referidas: a) foi realizada pesquisa bibliográfica com termos de busca relacionados com bactérias endófitas, filtrada para variedades agrícolas edíveis e normalmente consumidas cruas, e que pertencessem a grupos bacterianos também reportados em águas residuais e no microbioma humano; b) analisou-se a presença de ARB e ARGs em isolados bacterianos em vegetais edíveis (agrião e morango prontos para consumo); e c) foi avaliada a persistência de ARGs transportados por ARB isoladas de efluentes na presença de microbiota fecal de uma criança saudável. A investigação baseada na literatura teve como objetivo explorar a diversidade de bactérias endofíticas associadas a diferentes habitats (plantas, águas residuais e microbioma Resumo x humano) e inferir a probabilidade de que as ARB e ARGs possam ser transferidos das águas residuais para as plantas e depois para os seres humanos (Capítulo 3). Este estudo bibliográfico permitiu compilar uma lista de bactérias endofíticas distribuídas por mais de 20 filos reportadas em mais de 45 variedades de vegetais. Como o estudo procurava explorar as possíveis vias de transmissão para humanos, a lista de espécies agrícolas encontradas na literatura foi reduzida apenas a plantas que podem ser consumidas cruas, como sejam alface, cenoura, rabanete, pepino e tomate. Com o objetivo de avaliar a probabilidade dessas plantas captarem bactérias que podem atuar como vetores de resistência a antibióticos, a presença dos grupos bacterianos identificados como endófitos foi também investigada em comunidades microbianas de águas residuais e em microbiomas humanos. Para grupos bacterianos, cuja ocorrência foi relatada nos três tipos de ambiente, endófitos de plantas edíveis/cruas, águas residuais e microbioma humano, foi realizada uma análise exploratória com base em literatura e bases de dados públicas, de genes de resistência a antibióticos e de virulência. Este estudo sugere que bactérias relacionadas com géneros como Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas e Staphylococcus, cuja relação taxonómica com agentes patogénicos oportunistas e portadores de resistência a antibióticos, é conhecida, podem ser encontrados como endófitos em variedades agrícolas comestíveis, sugerindo que podem ser veiculados por águas residuais e ser transmitidos para o microbioma humano. Esses resultados sustentam a hipótese de que as bactérias transportadas pelas águas residuais, com propriedades fisiológicas e ecológicas semelhantes a bactérias endófitas, podem ser captadas por variedades agrícolas edíveis e, assim, se ingeridas, podem eventualmente colonizar o corpo humano. Deste modo, sugere-se que a irrigação com águas residuais pode aumentar os riscos de transmissão de bactérias clinicamente relevantes do meio ambiente para os seres humanos, através da cadeia alimentar. Com recurso a métodos dependentes da cultura, avaliou-se a diversidade de bactérias cultiváveis e resistentes a antibióticos que podem ser encontradas em associação com variedades edíveis, especificamente o agrião e morangos prontos para o consumo (capítulo 4). Os agriões prontos para consumo foram adquiridos em supermercados locais, enquanto as amostras de morangos foram colhidas ao longo de uma cadeia de processamento de frutas de uma empresa que produz preparados de frutas para a indústria alimentar. Estudou-se a fração microbiana das folhas de agrião e as bactérias associadas ao morango (comunidade epífita e endofítica). Os isolados de agrião (n = 68) e morango (n = 52) foram caracterizados fenotipicamente de acordo com seu perfil de resistência a antibióticos. Destes, selecionou-se uma coleção de isolados que exibia fenótipo de resistência a pelo menos três classes de Resumo xi antibióticos, para identificação com base na análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterização por reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, quanto à presença do gene da integrase de intregrões de classe 1, intl1, os ARGs sul1, blaTEM, blaCTX-M, blaOXA-A e blaSHV, e os grupos de incompatibilidade de plasmídeos com base nos tipos de origem de replicação FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1-Iγ, L/M, N, P, W, T, A/C, K, B/O, X, Y, F, e FIIA. Além disso, testou-se se as bactérias isoladas de morango e agrião poderiam adquirir ARGs por transformação. Observou-se que o agrião pronto a consumir apresentava contagens de heterotróficos totais na ordem de 3,5 x 107 ± 4,9 x 107 CFU/mL e 5,4 x 105 ± 6,2 x 104 CFU/mL de solução de lavagem de agrião para os supermercados A e B, respectivamente, enquanto o morango processado apresentava contagens de bactérias cultiváveis na ordem de 9,1 x 105 ± 1,8 x 105 CFU/g de peso seco de morango, com alguns dos isolados a apresentarem fenótipos de resistência a antibióticos. Algumas destas bactérias foram identificadas como membros dos géneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Erwinia, Rahnella, Methylobacterium e Chryseobacterium. Alguns destes grupos bacterianos foram anteriormente identificados com endófitos e géneros como Pseudomonas e Stenotrophomonas estão proximamente relacionados com patogénicos oportunistas que podem ser transportadores de ARGs adquiridos. A pesquisa de ARGs, intI1 e grupos de incomatibilidade de plasmídeos revelou que estes elementos genéticos foram encontrados numa pequena fração das bactérias analisadas (2 isolados). Além disso, resultados preliminares sugeriram que os isolados de agrião e morango podem ser suscetíveis a adquirir resistência a antibióticos e, assim, estar envolvidos na disseminação da resistência a antibióticos. O terceiro estudo baseou-se no argumento de que bactérias de águas residuais ou os seus ARGs poderiam ser rapidamente eliminados em presença da complexa comunidade da microbiota fecal. Este estudo foi realizado em ensaios de microcosmo com material fecal (FMAs) inoculado com bactérias isoladas de água residual, portadoras de genes de resistência a antibióticos conhecidos (Capítulo 5). Os isolados de águas residuais inoculados foram Escherichia coli (estirpe A2FCC14) e Enterococcus faecium (estirpe H1EV10), portadores dos ARGs blaTEM, blaCTX, blaOXA-A e vanA, respectivamente. O efeito de condições como a presença ou ausência de oxigénio ou os antibióticos cefotaxima ou vancomicina, na composição da comunidade microbiana do material fecal e na persistência dos ARGs exógenos foram investigados. Os FMAs foram monitorizados nos tempos 0, 1, 3 e 7 dias de incubação, com recurso a métodos de cultivo, PCR quantitativo (qPCR) e análises da comunidade bacteriana com base Resumo xii na sequência nucleotídica de amplicões do gene para o rRNA 16S. Na comunidade bacteriana do material fecal predominavam membros dos filos Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia. Esta comunidade sofreu aumento na abundância relativa de Proteobacteria, quando os FMA foram incubados na presença de oxigénio. A presença de doses sub-inibitórias de antibióticos não esteve associada a variações relevantes na composição da comunidade microbiana. Os ARGs das ARB inoculadas persistiram durante o período de 7 dias em todos os ensaios e, ao fim de 30 dias, podiam ainda ser quantificados, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose. A adição de doses sub-inibitórias de antibióticos não se correlacionou com variações significativas na persistência das ARB ou ARGs testados, quando comparados os respetivos controlos em antibióticos. Este estudo sugeriu que ARB que vivem em águas residuais podem persistir pelo menos por uma semana na presença de microbiota fecal complexa e, mesmo quando essas ARB estão abaixo do limite de detecção cultivável, os seus ARGs eram quantificáveis por qPCR. Esses resultados apoiam a hipótese de que, se as bactérias das águas residuais, por acaso, atingirem o intestino humano, poderá haver uma colonização bem-sucedida, um tema que merece mais investigação. No geral, a investigação realizada nesta tese sugere que as águas residuais tratadas usadas para irrigação podem conter bactérias com relevância clínica que, por essa via, podem estabelecer associação estável com culturas edíveis, como endófitos. Se, como consequência desse fato, essas bactérias atingirem o intestino humano, há indícios de que terão capacidade para ali persistir. Embora os presentes estudos evidenciem a complexidade desta questão, a tese apresentada sustenta que as águas residuais, as variedades agrícolas edíveis e os humanos podem estar interligados na cadeia de transmissão de ARB e ARGs. Assim, esta tese abre também caminhos para novas investigações neste domínio.
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