Expression and functionality of histone H2A2C in the mammary epithelium - Monteiro, Fátima Liliana Ribeiro Vieira (2018)
O cancro de mama é o tipo de cancro mais comumente diagnosticado entre as mulheres e também uma das primeiras causas de morte. Os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do cancro de mama são complexos e variam de individuo para individuo. Esta diversidade manifesta-se em alterações genéticas e/ou epigenéticas, tais como diferenças de padrões de expressão génica, aberrações cromossómicas, modificações de histonas e expressão diferencial de proteínas. Novos alvos e putativos biomarcadores para os tumores de mama invasivos são extremamente necessários e, uma vez que os padrões de expressão da histona H2A2C foram encontrados desregulados em células indiferenciadas este pode ser um bom objeto de estudo. Assim sendo, foram estudadas as diferenças de expressão de mRNA da histona H2A2C nos diferentes estados de diferenciação da linha celular epitelial mamária HC11 (proliferativa/ indiferenciadas, pre-diferenciado/competente e diferenciada/funcional) e de expressão de proteína por imunofluorescência. Para analisar a expressão de histona H2A2C na diferenciação da glândula mamária foi utilizada a técnica imunohistoquímica Além disso, para determinar se a expressão da H2A2C está associada a células em proliferação, utilizou-se a co-imunolocalização. A sequenciação por bissulfito foi utilizada para avaliar se a perda de expressão H2A2C nas células mais diferenciadas da linha celular HC11 estaria associada à metilação do promotor da histona H2A2C. E a técnica de ChIP ajudou-nos a estudar a interação das modificações pos-translaccionais das histonas (marcas activadoras: H3K36me2 e H3K79me3; marcas repressoras: H3K9me3 e H3K27me3) na região promotora da HistH2A2C. Uma vez que as células HC11 num estado mais indiferenciado são cultivadas em meio contendo EGF, com o intuito de verificar se as vias de sinalização Ras/Raf/MAPK e/ou PI3K/AKT/mTOR seriam responsáveis pela regulação da expressão da H2A2C, inibimos estas vias na linha celular HC11 e analisamos a sua expressão de mRNA e proteína por qRT-PCR e imunofluorescência, respectivamente. Adicionalmente, foram analisados os níveis de expressão da H2A2C numa série de casos de cancro da mama humano por qRT-PCR. Finalmente, estudou-se os efeitos fenotípicos do silenciamento da histona H2A2C nas linhas celulares HC11 e MC4L2 (carcinoma da mama). Foi observado que a expressão da histona H2A2C está relacionada com as células em estado estaminal da linha celular HC11 e a um estado de gravidez da diferenciação da glândula mamária de ratinho. Ao mesmo tempo, correlacionamos a expressão da histona H2A2C com a expressão do CD44 e do c - myc e a uma baixa expressão de E-caderina membranar, o que sugere que a histona H2A2C está relacionada não só com a indução da estaminalidade e proliferação, mas também com a repressão da diferenciação epitelial em células HC11. Esta última também foi confirmada por silenciamento do gene HIST2H2AC nas células HC11. O mecanismo de regulação da expressão da H2A2C ainda está por descobrir. No entanto, deixamos de lado a metilação do DNA como um evento putativo que poderia regular a expressão do gene que codifica a histona. Também, o papel da via PI3K/AKT na regulação da expressão H2A2C foi estabelecido. Finalmente, a expressão de H2A2C nos cancros da mama humanos foi confirmada. Em resumo, neste estudo, foram descritos pela primeira vez, a expressão e o papel da histona H2A2C quer no epitélio mamário quer no cancro da mama.