Identificação das vias de sinalização anti-apoptóticas em células estaminais cancerígenas de osteossarcoma - Gonçalves, Cláudia Borges (2012)
Introdução: O osteossarcoma é o cancro ósseo maligno primário mais frequente em crianças e adolescentes. Este tumor resulta da ocorrência de mutações genéticas e epigenéticas em células estaminais mesenquimais durante o processo de diferenciação osteoblática. Estudos recentes demonstraram que o osteossarcoma contém uma subpopulação de células com características de células estaminais cancerígenas (CSCs) e que são elas as responsáveis pela iniciação e progressão do tumor, bem como pela resistência às terapias convencionais incluindo a quimioterapia e radioterapia. Este trabalho teve por objectivo explorar o papel da via intrínseca ou mitocondrial da apoptose na resposta das CSCs aos efeitos citotóxicos da doxorubicina (DOX). Métodos: As CSCs foram isoladas a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo método de formação de esferas e incubadas com diferentes concentrações de DOX durante 48h. A citotoxicidade da DOX foi avaliada com base em vários parâmetros: efeitos sobre a viabilidade celular (método colorimétrico de MTT); proliferação celular (método de incorporação com BrdU) e indução de apoptose (ensaio de TUNEL). Os níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL, pró-apoptóticas Bak e Bax, e da caspase-3 foram analisados pela técnica de Western blot após incubação com DOX. Resultados: A cultura das células aderentes MNNG/HOS em condições de baixa aderência e na ausência de soro permitiu fazer o isolamento das CSCs sob a forma de colónias esféricas com elevada capacidade de auto-renovação. Os estudos de citotoxicidade mostraram que as CSCs são mais resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS. A concentração de DOX necessária para reduzir a viabilidade celular das CSCs em 50% foi de 2,21±0,50 μM, significativamente (p<0,05) superior à obtida para as células parentais MNNG/HOS (0,67±0,17 μM). Pelo contrário, a concentração de DOX que reduziu a proliferação celular em 50% foi de 0,03±0,01 μM para as CSCs, significativamente inferior (p<0,05) ao valor observado nas células parentais MNNG/HOS (0,19±0,06 μM). Nas células parentais MNNG/HOS observou-se um aumento na percentagem de células em apoptose dependente da dose de DOX variando de 1% a 21%, enquanto nas CSCs, a percentagem foi aproximadamente constante, nunca ultrapassando os 3% para o mesmo intervalo de concentrações. A exposição das CSCs à DOX induziu um aumento significativo nos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL e uma concomitante diminuição na expressão da proteína pró-apoptótica Bak e da caspase-3. Conclusões: A linha celular humana de OS MNNG/HOS contém uma subpopulação de células com propriedades de células estaminais que são relativamente mais resistentes à DOX do que as células parentais. A sobreexpressão da Bcl-2 e da Bcl-XL em simultâneo com a diminuição da Bak xvi parecem contribuir para a maior resistência destas células à apoptose induzida pela DOX. A capacidade que as CSCs têm em reduzirem a sua taxa de proliferação quando expostas a concentrações não tóxicas de DOX, permite-lhes evadirem efeitos citotóxicos da DOX que tem como alvo preferencial células com elevada actividade proliferativa. Palavras-chave: osteossarcoma; células estaminais cancerígenas; doxorrubicina; proteínas anti- e pró-apoptóticas, apoptose